4種飼料及1種飼料添加劑中拉沙洛西鈉的高效液相色譜檢測方法優(yōu)化

■韓鴻飛 程林麗黃家模 陳可心 趙軍杰 欒業(yè)輝

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100194）

2020年7月我國禁抗計劃[1]的實施減少了多種抗生素作為飼料添加劑使用，但同時可能會導(dǎo)致拉沙洛西鈉等少數(shù)仍被允許使用的抗生素濫用情況嚴(yán)重，在對這些藥物進(jìn)行監(jiān)測時，檢測范圍擴(kuò)大，檢測要求更高。目前我國拉沙洛西鈉的飼料檢測標(biāo)準(zhǔn)為《NY/T 724—2003飼料中拉沙洛西鈉的測定高效液相色譜法》[2]。由于該方法建立年代久，在多種飼料和現(xiàn)在的檢測限要求下不能滿足現(xiàn)階段對相關(guān)樣品監(jiān)控的需要。因此，優(yōu)化和建立切合目前實際檢測需求的分析方法具有重要意義。

拉沙洛西鈉（Lasalocid sodium）是一種芳香聚醚類離子載體型抗生素飼料添加劑，具有促生長和抗球蟲作用，但是長期及過量使用會對動物產(chǎn)生毒副作用，并造成動物可食性組織中藥物殘留等問題[3-4]。拉沙洛西鈉由5個同系物組成，即拉沙洛菌素鈉A、B、C、D和E（圖1）。除了美國AOAC官方標(biāo)準(zhǔn)方法測定飼料中5種化合物的總含量[5-8]，我國標(biāo)準(zhǔn)方法和國內(nèi)外其他相關(guān)文獻(xiàn)均只檢測拉沙洛菌素鈉A的含量，將其他4種成分作為雜質(zhì)看待[2-3]。

圖1 拉沙洛西鈉分子結(jié)構(gòu)

有關(guān)飼料等生物樣品中拉沙洛西鈉的檢測方法報道很多[3]，其中高效液相色譜法為其飼料樣品的常用檢測方法[9]，其次為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]，此外還有酶聯(lián)免疫檢測方法等[12]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在飼料中拉沙洛西鈉的多殘留分析中應(yīng)用很廣，該方法采用了二級質(zhì)譜模式，選擇性強(qiáng)，靈敏度高，但是對樣品前處理要求很高，需要對樣品進(jìn)行充分凈化處理；酶聯(lián)免疫方法僅作為快速定性分析處理，不適用于定量分析；高效液相色譜法的樣品前處理簡單、準(zhǔn)確度高、選擇性好，最適宜用于飼料中該藥物的含量分析。本試驗為找出操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，能夠滿足多種飼料和飼料添加劑樣品中拉沙洛西鈉的檢測方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，配Waters2475熒光檢測器；ME-T梅特勒-托利多分析天平；XPR梅特勒-托利多微量分析天平；VX200-T渦旋振蕩器；Sorvall ST8離心機(jī)。

1.2 試驗試劑

0.125 mol/L乙酸銨溶液-乙腈（15+85，V/V）；甲醇配制100 μg/mL拉沙洛西鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液于-18℃下密閉保存，有效期為1年。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液Ⅰ：準(zhǔn)確量取適量100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇-鹽酸（995+5，V/V）分別稀釋成0.05、0.1、0.5、1、5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液Ⅱ：準(zhǔn)確量取適量1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇-鹽酸（995+5，V/V）稀釋成0.5、1.0、5.00、10、50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用現(xiàn)配；拉沙洛西鈉標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：25999-20-6）：純度≥97%；創(chuàng)騰公司20%拉沙洛西鈉預(yù)混劑；甲醇、乙腈、三氟乙酸和乙酸銨均為HPLC級；鹽酸為36%～38%的分析純；試驗用水為純水；0.22 μm津騰有機(jī)微孔濾膜。

1.3 色譜條件

Athena C18-WP色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為35℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積分兩種，標(biāo)準(zhǔn)系列Ⅰ及低濃度樣品進(jìn)樣25 μL，標(biāo)準(zhǔn)系列Ⅱ及高濃度樣品進(jìn)樣2 mL；流動相為乙腈-0.125 mol/L醋酸銨（85+15，V/V）；熒光激發(fā)波長為314 nm，發(fā)射波長為418 nm。

1.4 樣品前處理

稱取試樣2 g（預(yù)混合飼料稱取1～2 g，精確到0.001 g）于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL甲醇-鹽酸（995+5，V/V），渦動1 min，8 000 r/min離心5 min。取1 mL上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測化合物個數(shù)的確定（見圖2、表1）

拉沙洛西鈉由5個同系物組成[4-7]，即拉沙洛菌素鈉A、B、C、D和E，其中拉沙洛菌素鈉A為主要成分，其他4種同系物含量極少，因此，我國原標(biāo)準(zhǔn)NY/T 724—2003中只檢測了拉沙洛菌素鈉A[2]。而美國AOAC官方標(biāo)準(zhǔn)方法在當(dāng)時的條件下分為兩種處理方式，低濃度條件時只檢測拉沙洛菌素鈉A，高濃度條件時計算5種化合物的總量[5-6]。

目前市場上能購得的拉沙洛西鈉標(biāo)準(zhǔn)品有拉沙洛西鈉和拉沙洛菌素鈉A兩種。為了判斷是否有檢測其他4種同系物的必要性，對拉沙洛西鈉標(biāo)準(zhǔn)品和拉沙洛菌素鈉A標(biāo)準(zhǔn)品以及20%拉沙洛西鈉預(yù)混劑進(jìn)行了分析。結(jié)果見圖2和表1，供試的預(yù)混劑中5種成分A成分占99.27%；供試?yán)陈寰剽c標(biāo)準(zhǔn)品中A成分占98.14%；供試?yán)陈寰剽cA標(biāo)準(zhǔn)品中A成分占98.13%。由此可知，拉沙洛西鈉的檢測中分析A成分是完全合理的，其他4種同系物可以當(dāng)成雜質(zhì)處理。

圖2 3種拉沙洛西鈉色譜圖

表1 3種拉沙洛西鈉的5個組分檢測結(jié)果

2.2 流動相的比較研究（見圖3）

NY/T 724—2003采用磷酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇（25+35+40，V/V，pH 7）為流動相，《NY/T 724—2003拉沙洛西鈉的測定高效液相色譜法》采用乙腈-125 mmol/L醋酸銨緩沖液（85+15，V/V，pH 4.75）為流動相，由此推斷中性或弱酸性條件均適合拉沙洛西鈉的檢測。而不調(diào)pH時醋酸銨溶液的pH為中性7左右，因此，保持其他檢測條件不變，對上述兩個標(biāo)準(zhǔn)方法的流動相與乙腈-125 mmol/L醋酸銨溶液（85+15，V/V）進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示，在測試的濃度范圍內(nèi)，乙腈-125 mmol/L醋酸銨緩沖液（85+15，V/V，pH 4.75）和乙腈-125 mmol/L醋酸銨溶液（85+15，V/V）的標(biāo)準(zhǔn)曲線區(qū)別很小，但磷酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇（25+35+40，V/V，pH 7）時標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率顯著低于前兩種流動相，而前兩種流動相中，不調(diào)節(jié)pH值時減少了工作量。因此選擇乙腈-125 mmol/L醋酸銨溶液（85+15，V/V）為流動相。

圖3 3種緩沖液流動相不同濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 提取條件的優(yōu)化（見圖4、圖5）

NY/T 724—2003采用甲醇為提取溶劑，常溫振蕩30 min，提取3次[2]。美國AOAC官方標(biāo)準(zhǔn)[5]方法采用甲醇-鹽酸（995+5，V/V）為提取溶液，40 ℃超聲20 min和40℃振蕩60 min，過夜后繼續(xù)振搖10 min，提取1次進(jìn)行樣品處理[4]。前者提取3次比較繁瑣，后者需要過夜處理時間太長。為了簡化操作程序，達(dá)到簡單高效的目的，分別采取上述兩種提取液，將提取步驟改成渦動1 min，分別對添加濃度為1 mg/kg和100 mg/kg的4種飼料和1種飼料添加劑樣品進(jìn)行添加回收試驗。試驗結(jié)果如圖4和圖5。甲醇提取的回收率普遍低于甲醇-鹽酸（995+5，V/V），而相對標(biāo)準(zhǔn)偏差卻遠(yuǎn)高于后者，且后者的準(zhǔn)確度和精密度完全滿足分析方法的要求。因此，本方法確定采用甲醇-鹽酸（995+5，V/V），渦動1 min提取樣品。

圖4 甲醇提取和酸化甲醇提取回收率

圖5 甲醇提取和酸化甲醇提取的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 方法性能檢驗（見表2、圖6）

采用通過上述研究確定的提取和檢測條件進(jìn)行檢測。對雞配合飼料、雞濃縮飼料、牛精料補(bǔ)充料、豬預(yù)混合飼料和貝殼粉進(jìn)行拉沙洛西鈉的空白添加回收試驗，雞配合飼料添加濃度為5、50 mg/kg和100 mg/kg；雞濃縮飼料和牛精料補(bǔ)充料添加濃度為10、100 mg/kg和200 mg/kg；豬預(yù)混合飼料和貝殼粉添加濃度為100、1 000 mg/kg和10 000 mg/kg，每個濃度設(shè)4～5個平行，重復(fù)3次。結(jié)果見表2。5種飼料和1種飼料添加劑的各藥物添加水平的平均回收率范圍為84.38%～100.33%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.86%～5.28%，批間變異系數(shù)為2.76%～8.76%。符合方法的準(zhǔn)確度和精密度要求。

表2 1 mg/kg 4種飼料和1種飼料添加劑中拉沙洛西鈉的添加回收試驗結(jié)果

對空白飼料樣品進(jìn)行4次樣品提取試驗，每次5個平行，共計20個空白飼料，分別以3倍和10倍平均信噪比計算各種飼料樣品的檢測限，結(jié)果測得雞配合飼料、雞濃縮飼料、豬預(yù)混合飼料、牛精料補(bǔ)充料以及貝殼粉中拉沙洛西鈉的檢測限依次為0.256、0.300、0.299、0.168、0.218 mg/kg；定量限依次為0.853、0.999、0.996、0.559、0.726 mg/kg。對各種飼料進(jìn)行1 mg/kg的添加回收試驗，回收率均大于80%，各飼料樣品的空白添加色譜圖見圖6。由圖6可知，在拉沙洛西鈉的保留時間位置，各飼料樣品均無雜峰干擾。

圖6 4種飼料和1種飼料添加劑樣品中拉沙洛西鈉（1 mg/kg）標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品、空白添加色譜圖

3 討論

通過對拉沙洛西鈉在4種飼料和1種飼料添加劑中檢測方法的優(yōu)化，得到了較為簡單、靈敏，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，能夠滿足多種飼料和飼料添加劑樣品中拉沙洛西鈉的分析要求的檢測方法。但同時也存在不足，如含乙酸銨的流動相容易造成色譜柱的殘留，需要定期強(qiáng)力沖洗再生。隨著色譜儀器在使用中的不斷改進(jìn)，含揮發(fā)性鹽如乙酸銨的使用逐漸被替換，這是今后要考慮的方向。