懷牛膝多糖的提取分離及生物活性研究進(jìn)展*

胡建平，孫延平，蘇發(fā)智，王洋洋，匡海學(xué)

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

（懷）牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata B1.的干燥根，呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，挺直或稍彎曲，長(zhǎng)15～70cm，直徑0.4～1cm，氣微、味微甜而稍苦澀，歸肝、腎經(jīng); 是一種中醫(yī)臨床上具有利尿通淋，逐瘀通經(jīng)，引血下行，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨藥用價(jià)值的藥材[1]。懷牛膝中含有多種主要化學(xué)成分，包括皂苷，甾酮類、多糖類、甜菜堿和多種微量元素等[2-5]。近年來，懷牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides, ABP）受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，藥理研究表明，ABP 是其重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并具有骨保護(hù)、抗癌、增強(qiáng)免疫等[6-8]生物作用；在臨床應(yīng)用和保健品中具有很大的開發(fā)潛力。為更好地合理利用中藥懷牛膝資源，本文綜述了關(guān)于ABP 的分離提取、含量測(cè)定和生物活性方面的研究。

1 懷牛膝多糖提取方法

多糖屬于易溶于水的極性大分子化合物，但難溶于乙醇，所以常用水溶劑法提取多糖并采用一定濃度的乙醇去除多糖中單糖、生物堿、有機(jī)酸等小分子雜質(zhì)。通常情況用熱水提取植物多糖，然后用高濃度的乙醇沉淀濃縮過后的水煎液得到粗多糖。采用傳統(tǒng)水煮提取法提取多糖，以苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量，通過單因素考察、正交試驗(yàn)優(yōu)選水煮提取法中料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)ABP 得率的影響；侯劍萍等人[9]得出各因素影響程度依次為：提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量，最佳工藝條件為：10 倍量水，提取 3 次，每次 2h；王媛媛等人[10]研究表明，ABP 的最佳提取工藝為料液比（g·mL-1）1∶13，提取時(shí)間 4h，提取次數(shù)3 次。傳統(tǒng)多糖提取方法往往存在有效成分損失大、工序復(fù)雜、提取周期長(zhǎng)、提取率較低等缺點(diǎn)。郭婕等人[11]通過對(duì)微波輔助法提取懷牛膝中多糖，通過單因素及正交試驗(yàn)篩選優(yōu)化，確立了ABP 微波提取工藝條件：微波功率 600W、料液比（g·mL-1）1∶20、浸取溫度為70℃、微波處理時(shí)間4min，在此條件下，ABP 的提取率可達(dá)12.37%。通過微波輔助提取和熱水浸提兩種方法提取懷牛膝莖葉多糖，對(duì)懷牛膝莖葉多糖的提取率分別為103.79、89.58mg·g-1，表明微波提取比傳統(tǒng)水提具有更大的優(yōu)勢(shì)，且微波輔助提取液表現(xiàn)出對(duì)農(nóng)桿菌及大腸桿菌的抑菌效果較好[10]。魏濤等人[12]在傳統(tǒng)水提法的基礎(chǔ)上，利用超聲波輔助處理，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)得出提取ABP 的適宜工藝為超聲波功率1000 W、提取溫度 60℃、提取時(shí)間 60min、料液比（g∶mL）1∶30；在此提取工藝條件下，粗多糖得率為 6.1%，體外抗氧化性實(shí)驗(yàn)表明，提取的ABP 具有較好的抗氧化性，對(duì)H2O2、O2-·和·OH 的清除率分別可達(dá)到 75.1%、90.3%和61.3%。

2 懷牛膝多糖的分離純化

由于初步制得的粗多糖中成分復(fù)雜，包含低聚糖、色素、蛋白質(zhì)及其他小分子雜質(zhì)，從而影響了多糖的純度。因此，為獲得高純度的多糖均一組分，需要對(duì)粗多糖進(jìn)一步提純。色素在粗多糖中通常以游離或者結(jié)合態(tài)存在，常用去除多糖中色素的方法包括物理吸附法、氧化法和離子交換法等；其中活性炭吸附法和雙氧水氧化法多被采用。Sevage 法、三氯乙酸（TCA）法、酶解法等是常用來脫多糖蛋白的方法，在ABP 的提取純化中，侯劍萍等[9]發(fā)現(xiàn)脫蛋白工藝中，三氯乙酸（TCA）法優(yōu)于 Sevage 法和鞣酸法，不僅可以有效去除蛋白，同時(shí)多糖成分損失較少，且可顯著去除表觀色素。此外，Sevag 法、殼聚糖絮凝法、三氯乙酸及酶解法這4 種脫蛋白方法經(jīng)脫蛋白實(shí)驗(yàn)對(duì)比后，發(fā)現(xiàn)酶解法能有效脫蛋白且具有操作簡(jiǎn)單、損失小、效率高的特點(diǎn)，并且還具有維持多糖活性及預(yù)防試劑危害等優(yōu)點(diǎn)[13]。由于粗多糖中含有一些蛋白復(fù)合物，因此，無法將多糖中的蛋白質(zhì)徹底除去。粗多糖中的小分子如氨基酸的除去等常用透析法，該方法的關(guān)鍵是選擇一種適宜的透析膜，以免多糖樣品的損失；另外，離子交換樹脂和凝膠色譜柱也常用來除去多糖中的小分子雜質(zhì)。

3 懷牛膝多糖的含量測(cè)定

多糖的含量檢測(cè)方法主要為化學(xué)法和色譜法兩類，其中化學(xué)法是利用組成多糖的單糖縮合反應(yīng)為基礎(chǔ)建立的間接測(cè)量多糖含量的方法，多用于總多糖的含量測(cè)定，如苯酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法等；這兩種方法由于操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、重現(xiàn)性好、試劑易獲取而在多糖含量測(cè)定被廣泛應(yīng)用。李根林等人[14]對(duì)比兩種方法處理ABP，選擇顯色靈敏度較高、穩(wěn)定性較好的苯酚-硫酸法測(cè)定8 個(gè)不同產(chǎn)地的ABP含量，結(jié)果顯示，河南武陟產(chǎn)地多糖較高達(dá)8.66%。而色譜法如氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）可直接測(cè)定多糖本身，多用于均一多糖的純度測(cè)定。

4 生物活性

4.1 抗癌

多糖是一種具有免疫刺激活性而能夠?qū)拱┌Y的物質(zhì)，可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)達(dá)到抗癌的目的，這被認(rèn)為是其抗腫瘤作用的主要機(jī)制且具有無毒的優(yōu)點(diǎn)[15]。

目前，關(guān)于多糖抗癌作用方面研究比較多。通過對(duì)比空白對(duì)照組、多糖不同濃度治療組，發(fā)現(xiàn)不同濃度ABP 均可抑制肺腺癌細(xì)胞LTEP-a-2 的細(xì)胞分裂、增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且低濃度時(shí)表現(xiàn)的更為明顯，這與以往的研究結(jié)果相一致[16]，即低劑量ABP可顯著抑制C57BL/6 小鼠Lewis 肺癌生長(zhǎng)，高劑量多糖無明顯抑制作用，但脾臟重量明顯增加，對(duì)小鼠的脾細(xì)胞毒作用明顯減弱，發(fā)現(xiàn)高劑量ABP 能顯著上調(diào)小鼠脾臟 IL-6 mRNA 和 TNF-α mRNA 的表達(dá)，提示小劑量牛膝多糖通過影響腫瘤細(xì)胞周期分布而抑制腫瘤生長(zhǎng)。ABP 作為一種轉(zhuǎn)移化學(xué)預(yù)防藥物可通過靶向EGFR 和EMT 安全地預(yù)防非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移，對(duì)EGFR 相關(guān)的非小細(xì)胞肺癌具有臨床意義[17]。另有研究表明，ABP 對(duì)S180 荷瘤小鼠有明顯抑瘤作用，且與化療藥物環(huán)磷酰胺（在無明顯抑瘤作用的劑量時(shí)）有協(xié)同抗腫瘤作用，ABP 能顯著提高S180 荷瘤小鼠脾細(xì)胞誘生LAK 細(xì)胞活性和TNF-β生成；對(duì)S180 細(xì)胞膜生化特性變化分析結(jié)果表明，ABP 引起細(xì)胞膜唾液酸含量升高、膜磷脂含量降低；提示ABP 對(duì)細(xì)胞膜生化特性與機(jī)體免疫功能的影響可能與其抗瘤機(jī)理有一定聯(lián)系。這些說明了ABP 在抗癌方面具備一定的治療潛力與開發(fā)價(jià)值。

4.2 免疫調(diào)節(jié)

機(jī)體的免疫功能包括特異性與非特異性機(jī)制。非特異性免疫也被稱為先天免疫或固有免疫，是指對(duì)所有具有一定抵抗力的病原微生物的防御，它沒有特殊的選擇性；特異性免疫是有選擇性地保護(hù)機(jī)體免受微生物或其產(chǎn)物的傷害，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。通常情況下，免疫作用是多層面、多途徑共同參與的[18]。免疫功能則是通過對(duì)非特異性免疫巨噬細(xì)胞、特異性免疫T 淋巴細(xì)胞、體液免疫B 淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子及免疫器官等的考察顯現(xiàn)出來。研究發(fā)現(xiàn), ABP 高劑量組能顯著提高雛雞的體液免疫、細(xì)胞免疫水平和免疫器官指數(shù)；表現(xiàn)在ABP 高劑量組的抗體效價(jià)高、可顯著提高雛雞外周血中CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞的百分率和CD4+/CD8+比值[19]。ABP 也可通過促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ana-1 細(xì)胞中TNF-α 因子分泌的途徑產(chǎn)生免疫活性來發(fā)揮抗炎活性，相比于川牛膝多糖體現(xiàn)出更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[20]。此外，免疫調(diào)節(jié)性植物化學(xué)物質(zhì)可增強(qiáng)斷奶仔豬的免疫應(yīng)答，在添加ABP 的斷奶仔豬中，通過調(diào)節(jié)抗體、補(bǔ)體 C3、C4，和細(xì)胞因子 IL-2、IFN-γ 的產(chǎn)生，提高了細(xì)胞和體液免疫水平，對(duì)感染的非特異性防御具有重要的保護(hù)作用[21]。這表明中草藥多糖ABP 作為一種天然的綠色飼料添加劑，可促進(jìn)斷奶仔豬的免疫應(yīng)答和健康生長(zhǎng)，為斷奶仔豬提供了一種有效的抗生素替代品。

4.3 抗骨質(zhì)疏松

ABP 是治療骨質(zhì)疏松癥的重要中藥，表現(xiàn)在對(duì)去卵巢大鼠骨密度、骨礦含量、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量和生物力學(xué)性能均有顯著的改善作用，說明ABP 對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松有顯著的治療作用[22]?；赨PLC/Q-TOF-MS 的代謝組學(xué)分析為評(píng)價(jià)牛膝多糖的抗骨質(zhì)疏松作用，確定了ABP 能顯著增加戊二酰肉堿、磷脂酰膽堿（18∶1）和9-順式維甲酸等生物標(biāo)志物，表明ABP 對(duì)脂質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用可能是治療骨質(zhì)疏松癥重要機(jī)制。楊軍英等人[23]發(fā)現(xiàn)ABP結(jié)合游泳訓(xùn)練能夠明顯延長(zhǎng)部分肝切除（PH）大鼠的游泳致力竭時(shí)間（P＜0.01），使骨髓增生程度更活躍，有核細(xì)胞數(shù)增多，紅細(xì)胞數(shù)量減少，促進(jìn)骨髓細(xì)胞 PCNA 的表達(dá)（和 PH 相比，P＜0.01）。這些反映了ABP 在治療骨質(zhì)疏松癥方面有很好的潛力。

4.4 抗病毒

采用氯磺酸-吡啶法對(duì)ABP 進(jìn)行硫酸化，用MTT 法檢測(cè)硫酸化后的ABP（ABPS）在MARC-145細(xì)胞上的抗呼吸綜合征病毒（PRRSV）活性，結(jié)果顯示，與未修飾的ABP 相比，ABPS 在較低濃度下表現(xiàn)出明顯的抗病毒活性，表明硫酸化修飾可以增強(qiáng)ABP 的抗病毒活性[24]。Peng 等人[25]對(duì)從懷牛膝中分離鑒定的ABP 硫酸化衍生物的體內(nèi)外抗人類免疫缺陷病毒1 型（HIV-1）活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)HIV-1 逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和HIV-1P24 抗原均有活性，其抑制逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶的半數(shù)抑制濃度分別為（2.948+/-0.556）mol·L-1和 （0.155+/-0.030）mol·L-1，其腹腔注射吸收良好，但口服生物利用度較差。

4.5 抗衰老

Deng 等人[26]探討了ABP 對(duì) D-半乳糖致衰老小鼠非酶糖基化的抑制作用及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ABP 能降低D-半乳糖衰老模型小鼠血清AGE 水平、皮膚羥脯氨酸濃度和自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性，提高淋巴細(xì)胞增殖和IL-2 活性，提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和紅細(xì)胞SOD 活性；表明ABP 對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠體內(nèi)非酶糖基化均有抑制作用，且通過對(duì)比枸杞多糖提示ABP的抑制作用更強(qiáng)。

5 結(jié)論和展望

本文綜述了ABP 的提取分離、純化、含量測(cè)定的方法及生物活性的介紹。微波和超聲波輔助提取分離多糖方法比傳統(tǒng)水煎煮法更具優(yōu)勢(shì)；ABP 具有廣泛生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗骨質(zhì)疏松和抗癌等作用。目前，研究主要集中在多糖的提取分離、含量測(cè)定、結(jié)構(gòu)表征與藥理作用方面，下一步需要進(jìn)一步優(yōu)化提純工藝，提高純度，明確其各級(jí)結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系，深入探討藥代動(dòng)力學(xué)及藥理作用機(jī)制，以擴(kuò)大我們對(duì)多糖功能效應(yīng)的認(rèn)識(shí)；本綜述也為懷牛膝更廣闊的應(yīng)用前景和價(jià)值研究奠定了基礎(chǔ)。