lncRNASNHG14/miR-331-3p/CCR1 軸在急性肺損傷中的作用機(jī)制研究

朱金源，白吉佳，張小亞

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，寧夏 銀川)

0 引言

急性肺損傷及其最嚴(yán)重的階段急性呼吸窘迫綜合征，是嚴(yán)重威脅患者生命的常見臨床危重癥，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，且病死率仍高達(dá)40%[1]。因此，探索急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制及有效治療措施頗有必要。LncRNA是一類新興的大分子非編碼 RNA，它與 miRNA 及其下游靶基因之間的相互調(diào)控作用同炎性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。miRNA 作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要因子，其活性可被lncRNA 通過“海綿”吸附的方式調(diào)控，此類 lncRNA 又被稱為競爭性內(nèi)源 RNA。lncRNA 作為競爭性內(nèi)源 RNA 競爭性地與 miRNA 結(jié)合，從而調(diào)節(jié)編碼基因的蛋白質(zhì)水平，并參與調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為。lncRNA 可作為競爭性內(nèi)源RNA 吸附 miRNA 調(diào)控肺上皮細(xì)胞凋亡，然而在急性肺損傷中發(fā)揮競爭性內(nèi)源功能的 lncRNA 目前仍知之甚少，因此，我們希望能進(jìn)一步探究競爭性內(nèi)源機(jī)制在急性肺損傷中的作用。

lncRNA SNHG14 在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，且作為競爭性內(nèi)源RNA 與miR-34c-3p 和WISP1具有靶向調(diào)控關(guān)系，下調(diào)SNHG14 可通過miR-34c-3p 介導(dǎo)WISP1，從而緩解脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，說明SNHG14/miR-34c-3p/WISP1 軸在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用[2]。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：脂多糖誘導(dǎo)后小鼠肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠肺組織中miR-331-3p 表達(dá)降低，說明miR-331-3p 可能也參與了急性肺損傷的進(jìn)程，但具體機(jī)制尚不明確。因此，我們猜測SNHG14 可能通過作為競爭性內(nèi)源吸附miR-331-3p，進(jìn)而促進(jìn)急性肺損傷的發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健 康 雄 性SPF 級(jí)C57/BL6 小 鼠54 只，6～8 周 齡，體 質(zhì)量(20±2)g，購于南京模式動(dòng)物所。實(shí)驗(yàn)開始前7d 飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫(24±1)℃，相對(duì)濕度40%～80%，給予正常飲食，自由飲水。

1.1.2 主要試劑和儀器

MH-S 細(xì)胞購自美國ATCC 公司，LPS 購自上海勁馬生物科技有限公司，LightCycler 480II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(瑞典Roche 公司)。

1.2 方法

1.2.1 miR-331-3p 的篩選以及與CCR1 靶向關(guān)系研究

(1)體外實(shí)驗(yàn)ALI 細(xì)胞模型的建立和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

體外培養(yǎng)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞(MH-S)，按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)換液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105 個(gè)/mL，每孔100μL接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)1h。對(duì)照組加入12K 培養(yǎng)基，除空白對(duì)照組外其余各組加入終濃度為100μg/mL 的LPS，培養(yǎng)18h，構(gòu)建ALI 細(xì)胞模型。根據(jù)細(xì)胞生長速度調(diào)整密度并鋪6 孔板，使細(xì)胞在第二日轉(zhuǎn)染時(shí)密度達(dá)80%-90%，使用lipofectmine2000(Invitrogen)試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

(2)熒光定量PCR 方法檢測急性肺損傷細(xì)胞模型中miR-331-3p 的表達(dá)水平

通過生物信息學(xué)篩選CCR1 上游miR-331-3p，檢測ALI細(xì)胞模型中miR-331-3p 的表達(dá)水平。按Trizol 方法說明書操作提取總RNA，設(shè)計(jì)miR-331-3p 和CCR1 引物，由Takara公司合成。使用PrimeScriptRT 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)定反應(yīng)條件為：37℃，15min×3 次(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃5s(逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng))。取反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR，參照SYBR?PremixExTaqTMII 試劑盒(RR820A，TaKaRa)說明書進(jìn)行PCR 操作。

(3)Elisa 檢測各組炎癥因子的表達(dá)水平

調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105 個(gè)/mL，每孔500μL 接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)1h，加入終濃度為100μg/mL 的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)液于離心管中，1500r/min 離心10min，取上清液，按照細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒的程序操作，檢測CRP、PCT、IL-1、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達(dá)。

1.2.2 SNHG14 吸附miR-331-3p 調(diào)控CCR1 的表達(dá)，參與ALI 進(jìn)程

使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測SNHG14 與miR-331-3p 的結(jié)合位點(diǎn)，采用雙熒光素酶試劑盒驗(yàn)證SNHG14 與miR-331-3p 的靶向關(guān)系。用Promega 公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System 檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SNHG14 調(diào)控CCR1 的表達(dá)，參與ALI 進(jìn)程

SPF 級(jí)雌性C57BL/6 小鼠54 只，8～10 周齡，隨機(jī)分為Model 組( 鼻 內(nèi) 滴 注LPS，1mg 溶 于5mL，N=120) 和Control組(鼻內(nèi)滴注等體積生理鹽水，N=15)。qRT-PCR 檢測各組SNHG14、miR-331-3p 和CCR1 的表達(dá)情況。

圖1 SNHG14 可能通過吸附miR-331-3p 調(diào)控CCR1 的表達(dá)

比較小鼠肺組織病理特征、肺水腫程度及肺損傷評(píng)分，并測定肺微血管通透性變化。

①HE 染色及Smith 肺損傷評(píng)分：取小鼠肺組織，10%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片5μm 厚。二甲苯脫蠟，乙醇復(fù)水，蘇木素染色7min，自來水沖洗，95%乙醇5s，伊紅染色1min。梯度乙醇水化，二甲苯透明，晾干，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。同時(shí)行肺組織Smith 評(píng)分，評(píng)價(jià)肺損傷的嚴(yán)重程度。②肺濕干重比(W/D)和肺水含量測定：收集小鼠右肺下葉，測定“濕”重。然后80℃干燥肺組織，48h 后測定“干”重，肺W/D=濕重/干重。同時(shí)，根據(jù)公式計(jì)算肺水含量，肺水含量=[(濕質(zhì)量一干質(zhì)量)/濕質(zhì)量]×100%。③比色法測定肺微血管內(nèi)皮通透性變化：小鼠尾靜脈注射伊文思藍(lán)50mg/kg，將小鼠開胸取肺臟0.1-0.3g，將肺浸泡在甲酰胺溶液中，置于37℃孵育72h，將組織中色素全部浸出，取出組織，離心后取上清液，用分光光度計(jì)在620nm 波長處進(jìn)行比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算伊文思藍(lán)含量，評(píng)價(jià)肺微血管內(nèi)皮通透性變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組標(biāo)準(zhǔn)化的樣本數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)，兩組之間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG14 可能通過吸附miR-331-3p 調(diào)控CCR1 的表達(dá)

RNA22 數(shù) 據(jù) 庫 分 析miR-331-3p 與SNHG14、CCR1 分別存在結(jié)合位點(diǎn)，通過雙熒光素酶驗(yàn)證，與NC mimic 相比，miR-331-3pmimic 與wt-SNHG14 共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著降低(P＜0.05)，miR-331-3p mimic 與SNHG14 被證實(shí)有靶向關(guān)系。另外，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，如圖1C 所示，與NC mimic 相比，miR-331-3pmimic 與wt-CCR1 共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著降低(P＜0.05)，miR-331-3p 與CCR1 被證實(shí)有靶向關(guān)系。qRT-PCR 檢測LPS 誘導(dǎo)下的MH-S 細(xì)胞和小鼠肺組織中miR-331-3p 明顯低表達(dá)(P＜0.05)。

2.2 SNHG14 與miR-331-3p 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

對(duì)miR-331-3p 與SNHG14 進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-331-3p 表達(dá)隨著SNHG14 表達(dá)升高而降低，并且與NC-ASO相比，SNHG14-ASO 中miR-331-3p 表達(dá)明顯升高，但是mut-SNHG14 組中miR-331-3p 表達(dá)無顯著變化，miR-331-3p 與SNHG1 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

3 討論

膿毒癥是宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的致命性器官功能障礙，而肺臟是膿毒癥時(shí)最易累及的器官，由膿毒癥引發(fā)的急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是膿毒癥患者死亡的主要原因[3]。研究表明，脂多糖是革蘭陰性菌致膿毒癥的主要抗原物質(zhì)，因而通過脂多糖誘導(dǎo)成為模擬急性肺損傷的經(jīng)典方式[2,4]。我們前期通過熒光定量PCR 檢測脂多糖誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠肺組織中l(wèi)ncRNA 表達(dá)情況，結(jié)果顯示SNHG14 高表達(dá)，因此，我們猜想 SNHG14 在急性肺損傷中可能發(fā)揮作用。SNHG14 在膠質(zhì)瘤中，通過作為“海綿分子”抑制細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。敲除SNHG14 基因可抑制缺血性中風(fēng)后釋放的炎癥細(xì)胞因子，從而對(duì)腦梗塞起保護(hù)作用，但目前尚缺乏SNHG14 在急性肺損傷中的研究[5]。本研究采用急性肺損傷經(jīng)典造模術(shù)式，通過氣管內(nèi)滴注脂多糖構(gòu)建急性肺損傷小鼠模型，蘇木精和伊紅染色觀察肺組織病理學(xué)改變，同時(shí)，體外培養(yǎng)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞，并給予終濃度為 100 μg/mL 的脂多糖刺激，培養(yǎng) 18 h，成功構(gòu)建急性肺損傷細(xì)胞模型。

研究發(fā)現(xiàn) miR-331-3p 在急性肺損傷中表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為miR-331-3p 可能是預(yù)測急性肺損傷的生物標(biāo)志物。為了進(jìn)一步明確miR-331-3p 在急性肺損傷中的作用機(jī)制，我們通過RNA22 數(shù)據(jù)庫及雙熒光素酶證實(shí)：miR-331-3p 與CCR1具有結(jié)合位點(diǎn)。趨化因子與各種炎癥反應(yīng)相關(guān)，參與中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)、募集和再循環(huán)。在急性肺損傷中，趨化因子可通過增強(qiáng)趨化因子受體(CCR)的表達(dá)，使中性粒細(xì)胞募集至肺臟，參與了肺臟的炎癥反應(yīng)[6]。在流感病毒和博萊霉素所致肺損傷模型中，CCR2 基因敲除鼠肺損傷程度明顯減輕；而CCR1 的拮抗劑可保護(hù)膿毒血癥所致肺損傷。然而對(duì)脂多糖所致肺損傷中CCRs 的調(diào)節(jié)作用卻鮮有報(bào)道[7]。我們前期通過生信分析預(yù)測SNHG14、miR-331-3p 和CCR1 具有結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)它們之間具有靶向關(guān)系，且脂多糖誘導(dǎo)后MH-S 細(xì)胞和小鼠肺組織中miR-331-3p 表達(dá)降低，說明miR-331-3p 可能也參與了肺損傷的進(jìn)程。

綜上所述，SNHG14 可能同樣作為ceRNA 吸附miR-331-3p，調(diào)控CCR1 的表達(dá)，從而參與急性肺損傷的進(jìn)程。