MSTN打靶豬的安全性分析

李誠瑜，劉昭君，申 明，李榮陽，陶景麗，吳望軍，劉紅林

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

1 MSTN基因簡介

Myostatin（MSTN）基因，中文名為肌肉生長抑制素基因，是轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族成員之一，是一種抑制肌肉生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子[1]。在胚胎發(fā)育階段，MSTN在生肌節(jié)細(xì)胞和發(fā)育的骨骼肌中表達(dá)，對肌纖維的數(shù)量起著非常重要的調(diào)控作用。在成年動(dòng)物體內(nèi)，MSTN在骨骼肌中特異表達(dá)，能有效控制肌纖維的生長[2,3]。而大量的研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因敲除和自然純合突變的小鼠、牛、狗和人類均表現(xiàn)出骨骼肌肥大的現(xiàn)象[4-7]。因此，MSTN是一個(gè)在多物種中影響肌肉生長發(fā)育的重要功能基因。

2 動(dòng)物遺傳修飾的概念與理解

動(dòng)物遺傳修飾（Genetic Modification）是指人為改變動(dòng)物的基因組（遺傳物質(zhì)），主要包括轉(zhuǎn)基因與基因敲除。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（Transgenic Animal）是指利用實(shí)驗(yàn)方法將外源基因?qū)雱?dòng)物染色體基因組內(nèi)，外源基因能在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)并穩(wěn)定遺傳給后代的一類動(dòng)物[8]。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的起源要追溯到1982年由Palmiter實(shí)驗(yàn)室做出的世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠[9]。自此，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)已在多個(gè)物種之中得到應(yīng)用，包括豬、牛、羊、兔、鼠、魚等[10-12]?；蚯贸侵覆捎没蚪M編輯技術(shù)去除基因組某個(gè)固有基因的部分序列，從而導(dǎo)致該基因功能下降或缺失[13]。

3 動(dòng)物基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)（Genome Engineering Technologies）是指對基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除或插入從而實(shí)現(xiàn)對基因功能的改造的一種技術(shù)，又稱基因打靶技術(shù)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物基因組的修飾中[14]。目前主要的基因編輯技術(shù)包括：巨核酶技術(shù)（Meganucleases）、鋅指核酸內(nèi)切酶（Zinc Finger Endon-uclease，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）、Cre/loxP系統(tǒng)、CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palind-romic Repeats-CRISPR-Cas9-associated proteins）技術(shù)、SGN技術(shù)，以及目前備受爭議NgAgo技術(shù)，其中研究最熱的屬基因組編輯技術(shù)當(dāng)屬CRISPR-Cas9系統(tǒng)[15,16]。CRISPR-Cas系統(tǒng)主要分為3種類型，其中Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)最為簡單，其利用gRNA結(jié)合到目的基因片段引導(dǎo)Cas9蛋白將DNA雙鏈切斷，實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)修飾。CRISPR-Cas9系統(tǒng)相對其他基因編輯技術(shù)有設(shè)計(jì)操縱更加簡便、編輯更加高效、通用性更廣等優(yōu)勢，已經(jīng)成為新一代基因組編輯技術(shù)，將為基因組定向改造調(diào)控與應(yīng)用等帶來突破性革命，為產(chǎn)生新的、基因編輯更加高效的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物帶來新的契機(jī)[17]。

4 MSTN基因編輯豬的安全性分析

隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，世界各地相繼報(bào)道了多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。運(yùn)用基因編輯技術(shù)科學(xué)家們可以定點(diǎn)、定時(shí)地對動(dòng)物基因組進(jìn)行基因的敲除與插入。為了獲得肌肉量更多的動(dòng)物，利用基因編輯技術(shù)敲除或改造肌肉生長抑制因子MSTN基因，使之失去對肌肉生長發(fā)育抑制的功能，從而生產(chǎn)出產(chǎn)肉率高的MSTN基因編輯動(dòng)物不失為一種高效的生產(chǎn)手段。那么通過基因編輯技術(shù)所獲得的MSTN打靶豬產(chǎn)肉量是否能提高，其所生產(chǎn)的豬肉是否與普通豬一樣安全？

近年來，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性受到社會各界的廣泛關(guān)注，其安全性和食品安全問題也是社會各界討論的熱點(diǎn)話題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)給人類創(chuàng)造巨大利益的同時(shí)，也帶來巨大挑戰(zhàn)，有人認(rèn)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可能對人類和生物環(huán)境產(chǎn)生重要影響，例如過敏性反應(yīng)、抗藥性問題、基因污染等問題。目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物安全性評價(jià)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，按照我國最新修訂的文件來看，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物安全性評價(jià)包括以下幾個(gè)內(nèi)容：分子特征、遺傳穩(wěn)定性、健康狀況、功能效率評價(jià)、環(huán)境適應(yīng)性、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物逃逸及其對環(huán)境的影響和食用安全[18]。

動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)相較于克隆技術(shù)，其產(chǎn)品的食用安全性也存在著較大爭議，世界糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）為此成立了專門的專家組討論轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品的食用安全性評價(jià)策略。目前最為普遍認(rèn)可的是“實(shí)質(zhì)等同性原則”[19]，即指出如果某個(gè)新食品或食品成分與現(xiàn)有的食品或食品成分大體相同，那么它們是同等安全的?！皩?shí)質(zhì)等同性原則”包括3方面內(nèi)容：被轉(zhuǎn)入基因的分子特征分析、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織的形態(tài)分析、所構(gòu)成食物的成分分析。

針對利用基因編輯技術(shù)生產(chǎn)的高產(chǎn)肉性能的豬肉是否能安全食用這一熱點(diǎn)問題，大量的MSTN相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)論偏向于MSTN基因編輯豬是安全的。

4.1 MSTN基因編輯豬無外源基因的整合

MSTN基因編輯豬只是利用基因編輯技術(shù)將其中一條染色體上的等位基因片段敲除了一部分，目的是使MSTN抑制肌肉生長發(fā)育的功能失活或減弱，并沒有外源基因整合到豬的基因組當(dāng)中去；另外，為了降低MSTN基因編輯豬表型異常的概率，對目標(biāo)基因只是進(jìn)行了單等位基因的編輯，也即只是減弱了MSTN抑制肌肉生長發(fā)育的效應(yīng)，而并沒有完全使之失活，這樣生產(chǎn)出來的MSTN基因編輯豬與普通豬相比，其他表型沒有太大差異。

4.2 無抗性標(biāo)記

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生產(chǎn)前期工作中，為了獲得陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，在細(xì)胞篩選過程中大多帶有抗性標(biāo)記，抗性標(biāo)記的存在可能會導(dǎo)致潛在的食用安全風(fēng)險(xiǎn)。而MSTN基因基因編輯豬完全是不帶有抗性基因，因此，不存在由抗性標(biāo)記基因帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

4.3 自然界早已存在MSTN基因突變的家畜動(dòng)物

近200年前就有人發(fā)現(xiàn)有些牛的肌肉異常發(fā)達(dá)，而在1997年時(shí)，美國科學(xué)家ALEXANDRAC.MCPHERRON發(fā)現(xiàn)比利時(shí)藍(lán)牛和皮埃蒙特牛都存在MSTN的自然突變，比利時(shí)藍(lán)牛MSTN基因第3外顯子上發(fā)生了11bp的缺失突變，該缺失導(dǎo)致MSTN蛋白的移碼突變，MSTN抑制肌肉生長發(fā)育的功能受到抑制[20]，這種突變的比利時(shí)藍(lán)牛全身肌肉異常發(fā)達(dá)，具有特別明顯的雙肌臀表型（如圖1與圖2所示）。而皮埃蒙特牛MSTN基因第3外顯子上發(fā)生G/A錯(cuò)義突變，使酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?，其突變同樣也會引起皮埃蒙特牛雙肌臀表型[21]。

另外，在羊上的研究同樣發(fā)現(xiàn)，在特塞爾綿羊（Texel sheep）MSTN基因g+6223G/A突變導(dǎo)致了miR-1與miR-206的結(jié)合位點(diǎn)缺失[22]，從而使MSTN蛋白翻譯受阻，最終導(dǎo)致了特塞爾綿羊肌肉的肥大（如圖3所示）。

如今，科學(xué)家在不同物種雙肌臀個(gè)體MSTN基因中發(fā)現(xiàn)了多種不同的突變，包括移碼、終止和缺失突變等，幾乎包含了所有突變類型。無論哪種突變，其結(jié)果都是改變MSTN基因抑制肌肉生長的效應(yīng)，導(dǎo)致雙肌臀表型的出現(xiàn)。由此可見，MSTN基因在自然界本身就存在許多天然突變，至今尚未見因食用這些突變物種的肉導(dǎo)致不適的報(bào)道。

綜上所述，通過基因編輯技術(shù)生產(chǎn)的MSTN打靶豬是安全的，它將為我們培育產(chǎn)肉量多的新品系豬提供新的契機(jī)與渠道。