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    鐵皮石斛組培工藝與優(yōu)化

    2021-01-12 07:37:40謝恩耀
    農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備 2020年12期
    關(guān)鍵詞:原球莖鐵皮石斛

    謝恩耀,金 琎

    (1.康師傅控股中央研究所,上海 201403;2.蘇州科技大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 蘇州 215009)

    鐵皮石斛具有養(yǎng)陰潤肺、利濕消腫、緩解神經(jīng)衰弱等作用,主要產(chǎn)于我國的江浙地區(qū),生長條件較為苛刻,發(fā)育過程遲緩,組織培養(yǎng)技術(shù)是解決其資源問題最有效的途徑[1]。近年來,張啟香等對石斛類原球莖進行液體培養(yǎng)的研究,并建立完善了石斛的液體培養(yǎng)技術(shù)[2]。

    鐵皮石斛種子、原球莖、幼苗莖段均可作為外植體進行組織培養(yǎng)[3]。目前較為成熟的技術(shù)體系為:外植體→原球莖→愈傷組織→叢芽→苗子[4]。培養(yǎng)基是組培過程中植株生長發(fā)育營養(yǎng)的來源,是組培成敗的關(guān)鍵因素。本研究選取性狀優(yōu)良的鐵皮石斛作為試驗組培外植體材料,進行原球莖的誘導(dǎo)試驗,對鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)基的生長因素進行分析篩選,并對其組培增殖體系進行系統(tǒng)地論證及優(yōu)化,為鐵皮石斛的資源化發(fā)展及快繁技術(shù)提供有效的技術(shù)支撐及保障。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料、培養(yǎng)基及激素

    試驗過程中的組培苗選自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院育苗基地,采用鐵皮石斛種子進行萌發(fā)并選育出表現(xiàn)形狀較為良好的幼苗。試驗過程中的相關(guān)試劑均依據(jù)文獻進行相關(guān)母液及激素的配置[11],試驗所用的試劑均購自國藥集團。

    1.2 培育條件

    光照時長控制在12 h/d,光照強度1 000~1 200 lx,培養(yǎng)過程中的環(huán)境溫度為25±1℃,培養(yǎng)基均分裝好后進行滅菌處理以減少分裝過程中的污染,滅菌前培養(yǎng)基pH=5.8[5]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 外植體滅菌

    根、莖、芽均取2 cm,試驗過程中處理3組平行,置于相同的培養(yǎng)條件下,50 d后對其成果率和污染率進行記錄,確定最佳滅菌方案。具體處理見表1,滅菌結(jié)果見表2。

    表1 鐵皮石斛外植體滅菌方法Tab.1 The sterilization methods for explants of Dendrobium officinale

    從表2中污染率和成活率的對比可知,滅菌效果最好的最別分別是編號8、5、6,根、莖、芽的污染率依次為5%、3%、2%;成活率最高的是編號5、8、1成活率為98%、97%、93%。

    表2 不同方法的滅菌結(jié)果Tab.2 The sterilization results of different methods

    2.2 原球莖的誘導(dǎo)

    2.2.1 培養(yǎng)基的選擇

    鐵皮石斛根、莖、芽分別接種至MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS 4種基本培養(yǎng)基中30 d,誘導(dǎo)出原球莖的順序依次為莖部、根部和芽。且MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)率最高,依次為90%、80%和70%;比較發(fā)現(xiàn),MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生鐵皮石斛生長的速率及增值質(zhì)量明顯高于1/2MS、1/4MS、1/8MS培養(yǎng)基(見圖1)。

    2.2.2 激素的選擇

    原球莖誘導(dǎo)過程中激素發(fā)揮著重要的作用,依據(jù)相關(guān)文獻資料可知,6-BA處理后可誘導(dǎo)愈傷組織的形成,KT可促愈傷組織分化,NAA、IBA、2,4-D等對生長具有促進作用[5],實驗過程中選取6-BA、NAA、2,4-D3種對誘導(dǎo)影響相對較大的激素進行正交試驗分析,進而得到不同種類的激素搭配比例對于愈傷組織生長過程所產(chǎn)生的影響。其結(jié)果如表3所示。

    表3 原球莖誘導(dǎo)正交實驗Tab.3 The orthogonal experiment of protocorm induction

    其中,MS+6-BA(0.4mg/L)+NAA(0.8mg/L)+2,4-D(0.2 mg/L)+20 g/L瓊脂+3%蔗糖在鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)過程中的誘導(dǎo)率最高,其最終誘導(dǎo)率為89%。極值R分析結(jié)果表明6-BA、NAA、2,4-D對其誘導(dǎo)影響次序為6-BA>NAA>2,4-D,對K值進行分析可知最優(yōu)的搭配方案為A2B3C1與表中6號組相吻合,因此原球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為:MS+6-BA(0.4 mg/L)+NAA(0.8 mg/L)+2,4-D(0.2 mg/L)+20 g/L瓊脂+3%蔗糖,其培育結(jié)果如圖2中所示。

    試驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)2,4-D施加濃度過高后會導(dǎo)致培育的愈傷組織出現(xiàn)黃化或者褐化的現(xiàn)象,試驗設(shè)置不同2,4-D的濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1)對其進行相關(guān)培養(yǎng),研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)2,4-D的施加濃度高于0.6 mg/L時,部分培育中的原球莖出現(xiàn)黃化現(xiàn)象,2,4-D的施加濃度越高,其培育過程中越容易死亡,這與羅吉鳳等及侯艷霞等研究所得出的結(jié)果相一致[7,8]。

    2.3 原球莖增殖

    在上文基礎(chǔ)上建立并優(yōu)化鐵皮石斛原球莖的組培增殖體系,旨在提高其組培繁殖速度。

    2.3.1 激素的選擇

    試驗選取KT、NAA、2,4-D 3種對原球莖增殖過程影響相對較大的激素進行正交試驗分析,進而得到不同種類的激素搭配比例對于原球莖生長過程所產(chǎn)生的影響。結(jié)果如表4所 示,其 中MS+KT(0.4 mg/L)+NAA(0.8 mg/L)+2,4-D(0.2 mg/L)+20 g/L瓊脂+3%蔗糖在鐵皮石斛原球莖增殖過程中的增值倍數(shù)最高,可達到3.5倍的增殖效果。極值R分析結(jié)果 表 明KT、NAA、2,4-D、瓊 脂 對 其 誘 導(dǎo) 影 響 次 序 為2,4D>NAA>KT>瓊脂,對K值進行分析可知最優(yōu)的搭配方案為A2B3C1D2、A3B3C1D2,其中A2B3C1D2與表中6號組相吻合,后續(xù)試驗對A3B3C1D2進行試驗驗證得到3.0的增殖倍數(shù),與A2B3C1D2的3.5倍增值倍數(shù)相比略低,因此6號組為原球莖增殖的最佳配比,其培養(yǎng)基配方為MS+KT(0.4 mg/L)+NAA(0.8 mg/L)+2,4-D(0.2 mg/L)+20g/L瓊脂+3%蔗糖。

    表4 原球莖增殖過程激素正交實驗分析Tab.4 The orthogonal experiment analysis of hormones in the process of protocorm proliferation

    2.3.2 不同氮磷比對原球莖增殖的影響

    氮和磷是MS母液中的大量元素,植物順利的培養(yǎng)與氮和磷這2種元素關(guān)系密切。王光遠等對鐵皮石斛花芽進行組織培養(yǎng)過程中研究發(fā)現(xiàn),MS中硝酸鉀和磷酸二氫鉀的濃度對芽繁殖在一定程度上具有抑制作用[8],其具體表現(xiàn)為KNO3和KH2PO4在組培過程中的添加濃度越高,其組培植物的增殖系數(shù)則會越低。

    原球莖在MS+KT(0.4 mg/L)+NAA(0.8 mg/L)+2,4-D(0.2 mg/L)+20 g/L瓊脂+3%培養(yǎng)基含有不同氮磷比的條件下培養(yǎng)50 d,每隔15 d對其增殖鮮質(zhì)量進行相關(guān)統(tǒng)計,如表5所示,通過表5可以看出在KNO3和KH2PO4濃度為950 mg/L、350 mg/L時,其增殖倍數(shù)可達到最高為1.07倍,經(jīng)統(tǒng)計分析可以直觀發(fā)現(xiàn)KNO3和KH2PO4的濃度越高,增殖倍數(shù)越低,與王光遠等人的實驗結(jié)果相吻合。

    表5 不同氮磷比對原球莖增殖影響Tab.5 The effects of different nitrogen and phosphorus ratios on the proliferation of protocorm

    2.4 原球莖的懸浮培養(yǎng)

    在試驗過程中原球莖通過懸浮培養(yǎng)的模式進行細胞擴增其結(jié)果相較于傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基培育模式可以獲得更加優(yōu)異的效果。本研究在不同的培養(yǎng)基上設(shè)計差異化的激素比例從中篩選出最佳的懸浮培養(yǎng)基配方。

    2.4.1 培養(yǎng)基組成的篩選

    分別在MS、B5、1/2MS中添加3%蔗糖、0.4 mg/L 6-BA、0.8 mg/L NAA,選擇生長一致的原球莖進行培育,每15 d記錄一次,50 d后統(tǒng)計其鮮質(zhì)量。

    從表6中可以看出,采用懸浮培養(yǎng)的方式對原球莖進行培養(yǎng)的過程中,B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)其增殖倍數(shù)可以達到最高,達到了3.45倍,含糖量可達9.56%。經(jīng)試驗論證最優(yōu)的培養(yǎng)基確定為B5+3%蔗糖+6-BA+NAA。

    表6 不同培養(yǎng)基對原球莖增殖和多糖所產(chǎn)生的影響Tab.6 The effects of different media on the proliferation of protocorm and polysaccharides

    2.4.2 不同激素含量對懸浮培養(yǎng)的影響

    以B5+6-BA+NAA+3%蔗糖為基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)50 d,期間記錄其鮮質(zhì)量值,據(jù)鮮質(zhì)量值選擇最優(yōu)的培養(yǎng)激素比例。從表7中可以看出隨著培養(yǎng)時間的提高,原球莖的鮮質(zhì)量呈上升趨勢,在NAA濃度為0.2 mg/L時,當(dāng)6-BA濃度為0.4 mg/L,原球莖鮮質(zhì)量均達到2.86 g;在6-BA濃度為0.2 mg/L,NAA濃度為0.4 mg/L時,原球莖鮮質(zhì)量達到2.81g;6-BA濃度為1 mg/L,NAA為1 mg/L,原球莖的鮮質(zhì)量為1.79 g。結(jié)果表明,在NAA施加濃度較低時,適當(dāng)提高6-BA的濃度,可以有效促進其增殖效果。在6-BA濃度較低時,適當(dāng)提高NAA濃度,反而對其增殖具有一定的抑制作用。

    表7 不同激素含量對原球莖懸浮培養(yǎng)的影響Tab.7 The effects of different hormone content on suspension culture of protocorm

    3 結(jié)論

    本研究采用種子萌發(fā)后所挑選獲得的性狀優(yōu)良的鐵皮石斛為組培外植體所需的材料,誘導(dǎo)原球莖產(chǎn)生,并對鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)基的關(guān)鍵因素進行分析篩選,對鐵皮石斛原球莖的組培增殖體系進行了相關(guān)的完善及優(yōu)化,通過對鐵皮石斛組培過程中生長發(fā)育的幾種關(guān)鍵因素的研究從而確定了不同培養(yǎng)狀態(tài)下的最優(yōu)培養(yǎng)基,分別論證了誘導(dǎo)過程、增殖過程、液體懸浮培養(yǎng)過程,從而為鐵皮石斛的大規(guī)?;斯づ囵B(yǎng)方式提供了切實可行的數(shù)據(jù)支撐。

    綜上所述,在組培過程中基礎(chǔ)培養(yǎng)基和激素均會對植株的培育過程產(chǎn)生較為顯著的影響,通過大量的正交實驗及對比分析最終所得到的優(yōu)化方案為:

    (1)原球莖誘導(dǎo)過程最優(yōu)培養(yǎng)基配比方案為:MS+6-BA(0.4 mg/L)+NAA(0.8 mg/L)+2,4-D(0.2 mg/L)+20 g/L瓊脂+3%蔗糖。

    (2)原球莖增殖過程最優(yōu)配方為:MS+KT(0.4 mg/L)+NAA(0.8 mg/L)+2,4-D(0.2 mg/L)+20g/L瓊脂+3%蔗糖。

    (3)懸浮培養(yǎng)最優(yōu)配方為:B5+6-BA(0.4 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)+3%蔗糖。

    在培養(yǎng)基的變更過程中經(jīng)過相應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)氮磷比對于組培植物有著較為顯著的影響,組培過程中隨著KNO3和KH2PO4在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含量的逐漸升高,其組培植物的增殖系數(shù)會出現(xiàn)顯著的降低。

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