響應(yīng)面法優(yōu)化酒大黃炮制工藝研究

曾昭君，田 甜，方朝纘，魏 梅，陳丹燕，鐘如帆

(廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

大黃為藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖，性苦、味寒，歸胃、脾、肝、大腸、心包經(jīng)，具有瀉下攻積、逐瘀通經(jīng)、涼血解毒、清熱瀉火、利濕退黃等功效，是臨床治療便秘的常用藥物[1]。大黃化學(xué)成分復(fù)雜，包含游離型和結(jié)合型蒽醌類衍生物、苯丁酮類、鞣質(zhì)類、苯酚苷類、二苯乙烯苷類等成分[2-3]，其中結(jié)合型蒽醌是大黃瀉下的主要成分[4]。大黃生品中蒽醌類成分既具有肝腎保護(hù)作用，也具有肝腎毒性，產(chǎn)生肝腎毒性的成分是結(jié)合型蒽醌[5-6]。大黃經(jīng)過酒炙后，瀉下作用的強(qiáng)度明顯下降，結(jié)合蒽醌的含量降低，毒性降低[7]。

2015年版《中華人民共和國藥典》中酒大黃飲片的炮制方法僅憑經(jīng)驗(yàn)炮制，缺乏客觀、量化的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，無法保證炮制質(zhì)量。本研究采用HPLC法測定蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚5種成分的含量，以結(jié)合蒽醌的含量為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法，通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對酒大黃的黃酒用量、悶潤時(shí)間、炒制時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考察，優(yōu)選酒大黃肝腎毒性較小的炮制工藝參數(shù)，為今后酒大黃的炮制工藝研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters公司)；Eclipse XDB C18色譜柱(柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm)；ME204E萬分之一分析天平(METTLER TOLEDO公司)；HF-25型多功能炒果子機(jī)(萬江富順機(jī)械廠)；二兩裝高速中藥粉碎機(jī)(111B型，浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)。

1.2 試藥

本研究所用大黃(批號：YG1903039)購自希美(重慶)制藥有限公司，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為蓼科植物藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖，經(jīng)檢驗(yàn)，均符合現(xiàn)行版中國藥典“大黃”項(xiàng)下的規(guī)定，其中大黃總蒽醌的含量為2.00%，游離蒽醌的含量為0.71%，結(jié)合蒽醌的含量為1.29%。

蘆薈大黃素對照品(批號：110795-201710)、大黃酸對照品(批號：110757-201607)、大黃素對照品(批號：110756-201512)、大黃酚對照品(批號：110796-201621)、大黃素甲醚對照品(批號：110758-201616，)均購自中國食品藥品檢定研究院；黃酒(紹興柯橋第三酒廠)；甲醇(西隴科學(xué)股份有限公司)；水為超純水(Milli-Q Direct超純水)；三氯甲烷(廣州化學(xué)試劑廠)；鹽酸(廣州化學(xué)試劑廠)；乙腈(默克股份有限公司)；磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 考察因素選擇

以黃酒用量、悶潤時(shí)間、炒制時(shí)間為考察因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，采用Design Expert 8.06軟件 Box-Behnken Design設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)因素與水平

2.2 炮制方法

按表1設(shè)置考察因素水平，對大黃進(jìn)行炮制：取大黃片100 g，加黃酒適量拌勻，悶潤一定的時(shí)間，置炒藥機(jī)器內(nèi)，用文火炒制規(guī)定的時(shí)間，取出，晾涼。取已炮制好的酒大黃，除雜，用二兩裝高速粉碎機(jī)粉碎，過65目篩，備用。

2.3 總蒽醌和游離蒽醌含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為 Eclipse XDB C18(柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；柱溫為30℃；檢測波長為254 nm；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 稱取蘆薈大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含40 μg的溶液；分別精密量取5種對照品溶液各2 mL，均勻混合，即得混合對照品溶液(每1 mL中各含8 μg的混合對照品溶液)。

2.3.3 供試品溶液的制備 ①總蒽醌供試品溶液的制備：精密稱定各炮制品粉末0.15 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失去的質(zhì)量，搖晃均勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置錐形瓶中，蒸去甲醇，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流60 min，放冷至室溫，轉(zhuǎn)置分液漏斗中，用三氯甲烷少量多次洗滌錐形瓶，并倒入分液漏斗中進(jìn)行萃取，上層(酸液)再用三氯甲烷萃取3次，每次加入三氯甲烷10 mL，合并三氯甲烷溶液，于通風(fēng)櫥中回收溶劑，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖晃均勻，濾過，取續(xù)濾液，即得總蒽醌供試品溶液。②游離蒽醌供試品溶液的制備：精密稱定各炮制品粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失去的質(zhì)量，搖晃均勻，濾過，取續(xù)濾液，即得游離蒽醌供試品溶液。

2.4 結(jié)合蒽醌含量測定

總蒽醌含量與游離蒽醌含量的差值，即為結(jié)合蒽醌的含量。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.3.2”項(xiàng)下混合對照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，得到6個(gè)濃度的混合對照品溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以各成分峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各成分的回歸方程，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，各標(biāo)準(zhǔn)曲線與峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表2 酒大黃各成分的線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定色譜峰面積，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值范圍為0.15%～0.84%，相對峰面積的RSD值為0.16%～0.97%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取酒大黃樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制定供試品溶液6份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行各成分峰面積測定，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD值為0.21%～0.69%，相對峰面積的RSD值為0.94%～2.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、18、24 h注入高效液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD值為0.13%～0.92%，相對峰面積的RSD值為1.24%～2.35%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 含量測定方法

稱取酒大黃樣品粉末適量，精密稱定，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各成分色譜峰面積，計(jì)算樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。色譜見圖1。

注：1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚

3 Box Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化炮制工藝

3.1 Box Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

打開Design Expert(8.06)軟件，選擇Box Behnken Design 設(shè)計(jì)，輸入黃酒量、悶潤時(shí)間、炒制時(shí)間3個(gè)因素的最低和最高水平，設(shè)置5個(gè)中心試驗(yàn)點(diǎn)，以結(jié)合蒽醌的含量(%)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)方案。方案與結(jié)果如表3所示。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 (%)

3.2 酒大黃炮制工藝響應(yīng)面分析

將表3中各組數(shù)據(jù)運(yùn)用Design Expert (8.06)軟件進(jìn)行分析，建立酒大黃炮制工藝中3個(gè)因素與結(jié)合蒽醌含量之間的二次回歸模型方程，即：Y=5.841 2-0.096 7×A-4.429 6×B-0.341 7×C-0.046 6×A×B-0.005 2×A×C+0.000 7×B×C+0.007 4×A2+1.783 9×B2+0.020 6×C2，式中，Y代表酒大黃中結(jié)合蒽醌的含量，A、B、C分別代表黃酒用量、悶潤時(shí)間、炒制時(shí)間。

運(yùn)用Design Expert (8.06)軟件對結(jié)合蒽醌的含量與3個(gè)因素的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 方差分析

由表4可知，模型的P值為0.0160(P<0.05)，表明所建的回歸模型具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。失擬項(xiàng)P=0.1049(P>0.05)，模型失擬度不顯著，表明所得方程與實(shí)際擬合中的異常誤差所占比例較小，模型擬合情況良好，能較好地反映真實(shí)值；模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.8797，表明該模型可以解釋3個(gè)因素87.97%的變異性，反映酒大黃中結(jié)合蒽醌的含量與黃酒量、悶潤時(shí)間和炒制時(shí)間關(guān)系密切，可以用來對酒大黃的炮制工藝參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測。

該模型中方差分析結(jié)果顯著的分別是二次項(xiàng)B2和C2，表明悶潤時(shí)間、炒制時(shí)間2個(gè)因素對結(jié)合蒽醌含量的影響極為顯著；交互項(xiàng)AB、AC、BC對結(jié)合蒽醌含量的影響力強(qiáng)弱順序?yàn)椋篈C>AB>BC。

由分析結(jié)果繪制三維響應(yīng)面圖和等高線圖，研究黃酒用量、悶潤時(shí)間、炒制時(shí)間3個(gè)考察因素對結(jié)合蒽醌含量的影響及其交互作用，結(jié)果如圖2。因素AB、AC的交互作用稍強(qiáng)，因素BC交互作用稍弱，交互項(xiàng)對結(jié)合蒽醌含量的影響力強(qiáng)弱順序?yàn)椋篈C>AB>BC，與表4方差分析結(jié)果一致。

3.3 最佳炮制工藝預(yù)測及試驗(yàn)驗(yàn)證

通過Design Expert 8.06軟件對回歸模型進(jìn)行分析，可以預(yù)測酒大黃最佳炮制工藝為每100 g藥材黃酒用量14.60 g，悶潤時(shí)間為1.43 h，炒制時(shí)間為10.13 min，此時(shí)結(jié)合蒽醌的含量預(yù)測值為0.24%。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際需要，大黃酒炙后得最終炮制工藝參數(shù)為每100 g藥材黃酒用量為15 g，悶潤1.5 h，炒制10 min。

采用上述工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到結(jié)合蒽醌的含量為0.23%，實(shí)際測定值與理論預(yù)測值低0.04%。結(jié)果表明，所建立的回歸模型適用于酒大黃結(jié)合蒽醌含量的預(yù)測，與實(shí)際情況有較好的擬合性，其優(yōu)化得到的炮制工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠、科學(xué)。見表5。

圖2 各因素響應(yīng)面圖

表5 工藝驗(yàn)證 (%)

4 討論

大黃味苦性寒，瀉下作用峻烈，在臨床應(yīng)用中容易引起腹痛、惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)。大黃瀉下成分主要是結(jié)合蒽醌類成分，結(jié)合蒽醌類成分構(gòu)架不穩(wěn)定，經(jīng)酒炙后，受黃酒用量、炮制溫度、加熱時(shí)間的影響，結(jié)構(gòu)容易被破壞，結(jié)合蒽醌含量較生大黃少[8]，瀉下作用的強(qiáng)度明顯下降，減輕生大黃“苦寒?dāng)∥浮钡母弊饔茫杀苊鈱?dǎo)瀉中引起腹痛、嘔吐等不良反應(yīng)[7-9]。

大黃中結(jié)合型蒽醌類成分對機(jī)體肝腎功能有不良影響，長期使用可能引起肝腎損傷，結(jié)合蒽醌含量的降低可減小肝腎毒性[10]。有研究表明，大黃經(jīng)酒炙后，結(jié)合型蒽醌含量下降，瀉下作用的強(qiáng)度明顯下降，毒性降低[9]。

綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇結(jié)合型蒽醌類成分作為響應(yīng)值考察酒大黃炮制工藝，結(jié)合蒽醌含量的降低，表明酒大黃的炮制合格。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃酒炙后，結(jié)合蒽醌含量下降明顯(自1.29%下降至0.23%)，最佳炮制工藝為每100 g藥材加入15 g黃酒，悶潤1.5 h，炒制10 min，此結(jié)果可為工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的參考依據(jù)。