病理切片制作技術(shù)的改進(jìn)及臨床應(yīng)用

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000)

病理制片技術(shù)是病理學(xué)的重要組成部分，廣泛應(yīng)用于臨床和科研。制作精良的病理切片是確保病理學(xué)診斷準(zhǔn)確率的關(guān)鍵，從而決定下一步的治療方案。常規(guī)石蠟切片是病理制片工作中的主要內(nèi)容，是目前病理診斷最常用的方法。切片制作過程中各個環(huán)節(jié)都是相互關(guān)聯(lián)、相互影響的，每一個環(huán)節(jié)的失控都會導(dǎo)致切片出現(xiàn)質(zhì)量問題。實(shí)施質(zhì)量監(jiān)控是保證切片質(zhì)量的基礎(chǔ)。因此，必須在每一環(huán)節(jié)上制定出具體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并實(shí)施必要的監(jiān)督。

1 材料與方法

1.1 材料

來源于2012～2017年菏澤醫(yī)專附屬醫(yī)院病理科工作的活體組織標(biāo)本。

1.2 方法

對送檢標(biāo)本進(jìn)行固定、脫水、透明、包埋、制作切片及染色等處理。

2 結(jié)果

由于在制作切片的各個環(huán)節(jié)采取相應(yīng)的改進(jìn)措施，切片質(zhì)量高，色澤鮮艷，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核呈深藍(lán)，染色質(zhì)顆粒清楚，核膜清晰，細(xì)胞質(zhì)呈桃紅色，核漿染色對比清晰，層次分明。

3 討論

3.1 準(zhǔn)備工作

近年來，病理制片設(shè)備發(fā)展的越來越先進(jìn)，應(yīng)用的更為普遍.首先要注重儀器的日常維護(hù)，每次使用切片機(jī)前應(yīng)把機(jī)器上有關(guān)螺絲擰緊,需要上油的上好油。使用后徹底清理,定時上油。建立儀器使用記錄。記錄每種試劑的更換時間及處理的標(biāo)本數(shù)量。

3.2 固定

標(biāo)本離體后要馬上固定。因?yàn)樾?biāo)本不及時固定會發(fā)干變硬，一些特殊組織如淋巴組織固定不及時易引起自溶。固定要充分，標(biāo)本放入足量的固定液中，要完全浸沒，固定時間大標(biāo)本要24 h以上、小標(biāo)本4～6 h。固定液的選擇非常重要，首選10%中性福爾馬林，特殊組織可采用無水乙醇。固定液的濃度適宜,濃度過高使組織蛋白質(zhì)沉淀硬化,表面形成硬殼,減弱固定液向組織內(nèi)部滲透能力,使組織內(nèi)部固定不佳，切片出現(xiàn)灰染;若濃度低或時間短，固定不充分,造成組織自溶或腐敗。經(jīng)充分固定的標(biāo)本,后續(xù)操作中細(xì)胞、組織保持形態(tài)不變，有利于脫水,透明切片時也容易進(jìn)行,染色時不易脫片;若標(biāo)本固定不好,可能發(fā)生細(xì)胞變形或組織自溶現(xiàn)象，并且影響脫水透明,染色時易脫片易退色,導(dǎo)致鏡下模糊不清,出現(xiàn)片狀發(fā)白區(qū)。

3.3 取材

病理技術(shù)人員要掌握組織器官的結(jié)構(gòu)，由此決定切面的走向。例如皮膚要有表皮和真皮,腸壁和胃壁要有黏膜和肌層。腎臟要有皮質(zhì)和髓質(zhì)，此外盡量除去多余或無關(guān)的組織[1]。切面要平整，切片刀剪要保持鋒利，否則取材者來回拖拉,可導(dǎo)致組織受撕扯嚴(yán)重而發(fā)生變性。大標(biāo)本要多部位取材,所取組織應(yīng)大小適中、薄厚一致、形狀規(guī)整。不同組織厚薄可靈活掌握，質(zhì)地致密的組織可切薄一些，質(zhì)地疏松的組織可取厚一點(diǎn)。特殊組織特殊處理，如骨組織或鈣化組織要充分脫鈣后,用大頭針輕扎可穿過組織,即可取材。

3.4 脫水

標(biāo)本組織中往往含有大量的水分，水與石蠟是不能相溶的，要想使組織浸蠟完全，必須將水份徹底脫凈。乙醇為首選脫水劑，可以任意調(diào)整濃度，高濃度乙醇使組織催化或收縮,會導(dǎo)致組織變硬變脆。一般采用從低濃度到高濃度，脫水效果好，如果脫水不凈，切出的片子很厚，結(jié)構(gòu)不清，鏡下呈云霧狀。如果時間太長，則會導(dǎo)致組織硬化，給切片帶來困難。切片不要在空氣中停留太久，否則會吸取水分，出現(xiàn)云霧。脫水試劑易揮發(fā)導(dǎo)致濃度降低，要定期更換并記錄。

3.5 透明浸蠟

傳統(tǒng)用二甲苯透明的組織容易發(fā)硬發(fā)脆，切片容易出現(xiàn)破碎。并且二甲苯有一定毒性,對人體損害比較大，且污染環(huán)境。建議使用硬脂酸和石蠟混合液透明，比例為1∶20，硬脂酸濃度過高易掉片，濃度過低透明效果差[2]。硬脂酸氣味清淡毒性輕微，能軟化對較硬的組織,易切出完整切片; 硬脂酸對組織中的抗原不產(chǎn)生影響,不影響免疫組化染色結(jié)果[3]。使用硬脂酸透明浸蠟簡化程序，節(jié)約時間。要控制好蠟溫，保持在75℃，溫度過高，組織收縮變硬變脆，溫度過低，硬脂酸溶解不全形成小顆粒，在切片中出現(xiàn)云霧狀，影響鏡下觀察。

3.6 包埋

包埋石蠟熔點(diǎn)過低，會導(dǎo)致切片過厚及冷凝后組織與石蠟分離，一般石蠟的溫度要比組織高4～6℃。但是溫度也不要過高，以免組織發(fā)生變性，出現(xiàn)灰染。實(shí)驗(yàn)室最好保持恒溫，以防外界溫度變化影響效果。包埋時動作要輕準(zhǔn),禁忌將組織來回翻動,否則也可導(dǎo)致組織與石蠟分離。包埋時注意方向,將組織塊最大平面向下包埋。要注意石蠟的質(zhì)量及操作環(huán)境，避免出現(xiàn)縫線、異物、沙粒等。

3.7 切片

切片是保證質(zhì)量的最重要環(huán)節(jié),切片前應(yīng)將刀磨鋒利,檢查切片機(jī)各個螺旋，確保擰緊。蠟塊不要過硬，否則容易出現(xiàn)跳刀，出現(xiàn)波浪樣或搓衣板樣改變?？梢酝ㄟ^調(diào)整刀刃與蠟塊的角度(15～20°夾角)避免出現(xiàn)此類現(xiàn)象。切片時需特別注意厚度，不論哪種切片機(jī)，固定刻度時降低1～2 μm，切出的厚度會在 4～6 μm。過厚的切片容易發(fā)生脫落、重疊或有褶皺，影響觀察結(jié)果。切片時還需注意蠟塊位置，修整蠟塊時保證組織全部暴露于切面，刀片與組織結(jié)構(gòu)走向保持平行，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織,把難切的部分朝上放, 細(xì)小組織,需切多個切面，以保證切片完整，以防止發(fā)生漏診。

3.8 漂片

漂片水槽溫度一般控制在55℃左右。水溫低,切片不易自行展開;水溫高,會導(dǎo)致組織間隙增大。切片上避免出現(xiàn)從水底產(chǎn)生的氣泡，這樣既防止脫片又提高切片清晰度。

3.9 烤片和脫蠟

注意時間和溫度，烤片時間短或者溫度低，會影響組織粘附載玻片，導(dǎo)致脫片，一般在60℃恒溫箱烤30 min以上或溫度較高的烘片器中烤片10 min以上,溫度高時間長,切片發(fā)灰染色不清，細(xì)胞收縮或出現(xiàn)炸片。要徹底脫蠟，否則切片會出現(xiàn)染色不勻,組織結(jié)構(gòu)模糊不清。組織脫蠟透明液是一種無色無毒的芳香氫化脂肪烴,可替代二甲苯用于脫蠟,操作步驟同二甲苯，用后可直接倒棄,不會污染環(huán)境及毒害人體。

3.10 染色

一張優(yōu)良的病理切片,染色是關(guān)鍵。配制蘇木精染液時，加入冰醋酸可抑制蘇木素對胞漿的著色力，將冰醋酸的加入量控制在總液量的4%[1，2]。醋酸濃度高減弱細(xì)胞核著色力，濃度低引起核漿共染。在入蘇木精染液之前一定要水洗3遍以上以除酸，使組織切片接近中性，以確保染色力持久，染色效果好，利于切片長期保存。如出現(xiàn)蘇木精沉渣必須更換染液。蘇木素液在空氣中容易氧化，產(chǎn)生氧化膜，在加熱染色后更易產(chǎn)生，可在染色前過濾染液,保持染液潔凈，避免組織切片污染。使用完立刻保存在密封棕色容器內(nèi)防止氧化,延長使用壽命。當(dāng)染液使用一段時間后，有效成分揮發(fā)消耗引起核漿共染，影響分化效果，要及時更換。1%的稀鹽酸分化，分化時間一般為2～3 s。分化程度要在鏡下觀察，分化不足導(dǎo)致胞質(zhì)藍(lán)染，影響伊紅上色;分化過度核太淺,通過延長溫水中返藍(lán)時間(5～10 s)解決。胞質(zhì)染色的關(guān)鍵是伊紅染液的pH值，100 mL的1%伊紅液加1滴的冰醋酸，胞質(zhì)較易上色。

3.11 脫水和封固

脫水通過從低濃度酒精到高濃度酒精,低濃度酒精有分化伊紅作用,使伊紅褪色，放置時間要短(30 s)，無水酒精1～3 min。脫水不徹底或在空氣中停留時間過長使切片發(fā)霧 ,鏡下組織結(jié)構(gòu)模糊不清。封片常用中性樹膠,樹膠稠稀適當(dāng)。如用電吹風(fēng)吹干后干燥封片,易引起組織干涸使組織細(xì)胞收縮龜裂,影響染色效果?？捎秒姶碉L(fēng)把蓋玻片稍微吹一下,再封片。封片過程中工作人員戴口罩，不能對著切片呼氣，會影響透明度，動作輕柔，避免產(chǎn)生氣泡。

4 臨床應(yīng)用

病理檢查作為臨床上診斷眾多疾病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，更具有直觀性和客觀性。在以往研究中，病理診斷的準(zhǔn)確性取決于臨床對組織細(xì)胞取材、固定、脫水、切片等各個環(huán)節(jié)的質(zhì)控，且最終的組織染色質(zhì)量對疾病診斷可產(chǎn)生直接影響。因此在切片制作中對不同組織的取材要求也不盡一致，如取材范圍、方法、工具等，都會影響對標(biāo)本組織的擠壓，造成組織結(jié)構(gòu)變形、變異[1-3]。另外，HE染色質(zhì)量也容易受到各項措施的影響，因此在臨床病理診斷中要更加強(qiáng)調(diào)標(biāo)本類型的不同，酌情選擇相應(yīng)的方法與工具完成。臨床上對于需送檢的病理組織，首先應(yīng)給予有效的固定，其目的在于促使組織、活體成分、形態(tài)獲得最大化的保障，防止在后續(xù)操作中可能出現(xiàn)的組織自溶、組織現(xiàn)存結(jié)構(gòu)被破壞甚至完全消失后，對臨床診斷產(chǎn)生嚴(yán)重影響。HE染色是臨床病理的常規(guī)染色方法，切片需要使用1種及以上染料，將組織中各物質(zhì)顯現(xiàn)出來，通過光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)。高質(zhì)量的切片有助于臨床獲得更加可靠的證據(jù)，反之若切片染色一團(tuán)糟，結(jié)構(gòu)不清、層次不明則可導(dǎo)致診斷結(jié)果誤差。在病理技術(shù)改進(jìn)后，通過與改進(jìn)前的對比顯示其染色結(jié)果明顯更優(yōu)，臨床診斷率均以此提升。由此提示病理HE染色在臨床病理診斷中具有較好效果，但通過改進(jìn)后有助于提升其染色效果，為疾病的確診、后續(xù)治療方案的構(gòu)建提供更加準(zhǔn)確的依據(jù)。

綜上所述,病理制片在臨床中有著重要的地位，病理技術(shù)人員要確保病理診斷的正確率，必須有高度的責(zé)任心、熟練的操作技術(shù)，密切配合診斷醫(yī)師,影響切片質(zhì)量的因素有很多，只有認(rèn)真對待，注意操作中的每一細(xì)節(jié), 只要刻苦研究業(yè)務(wù)，并且在實(shí)踐中不斷摸索、創(chuàng)新,才能為臨床診斷制出高質(zhì)量的病理切片,提升臨床診斷準(zhǔn)確性。提升切片質(zhì)量，有望成為臨床病理檢查金標(biāo)準(zhǔn)，對此仍需不斷提高制作技術(shù)與研究報道，為臨床診斷與疾病的治療方案構(gòu)建提供依據(jù)。