環(huán)狀RNA在肺腺癌中的作用及機制研究進展

黃小碧，周宏蓮，楊志雄，喻慧，蘇文媚

1廣東醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東湛江524001；2廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤中心

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，根據組織病理學，肺癌分為非小細胞肺癌（NSCLC，85%）和小細胞肺癌（15%），其中肺腺癌是NSCLC的主要組織類型［1］。盡管在手術切除、化學療法和放射療法方面已取得一定進展，但肺腺癌的5年生存率仍較低［2］。其主要原因可能是免疫系統(tǒng)的抑制、細胞的增殖、腫瘤的遠處轉移以及藥物的抵抗［3］。因此，迫切需要找到肺腺癌的新型早期診斷生物標志物和治療靶標。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中的一類靶目標是非編碼RNA。環(huán)狀RNA（circRNA）是一種特殊的非編碼RNA，具有環(huán)狀共價閉合結構，對RNA核酸核酶的耐受性更高，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性，且它的異常表達與多種癌癥相關，如結腸癌［4］、肝細胞癌［5］、卵巢癌［6］等，發(fā)揮致癌或抑癌作用。已有研究證實，circRNA在肺腺癌組織和癌旁組織以及肺腺癌不同TMN分期中存在差異性表達，在肺腺癌的增殖、轉移和預后等方面起一定作用，可作為肺腺癌預測或預后的生物標志物，為早期治療提供了新靶點和新思路?，F(xiàn)就circRNA在肺腺癌中的作用及作用機制進行綜述。

1 circRNA在肺腺癌中的作用

1.1 臨床作用 目前，肺腺癌的診斷主要有賴于影像學診斷和病理診斷，但病理活檢有一定的創(chuàng)傷性，而影像學診斷在早期的診斷存在一定的局限性。有多項研究已經證實了circRNA在消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等疾病中能作為早期診斷或預后的生物標志物。circRNA是否能成為生物標志物應用于肺腺癌的早期診斷和治療靶點，目前成為國內外研究的熱點。ZHAO等［7］采用高通量circRNA微陣列技術檢測4對早期肺腺癌組織和正常組織，發(fā)現(xiàn)腫瘤樣品中共有357個circRNA失調，有5個circRNA（hsa_circ_0404833、0406483、0006411、0401977、0001640）差異表達顯著，提示circRNA在早期肺腺癌中具有潛在的預測作用，也為肺腺癌的遺傳學研究提供了新的思路。ZHU等［8］發(fā)現(xiàn)近60個circRNA分子在肺腺癌組織中的表達有改變，并證明hsa_circ_0013958在肺腺癌中過表達，其表達水平與TNM分期和淋巴轉移相關，肺腺癌診斷的受試者工作特征（ROC）曲線下面積為0.815，提示hsa_circ_0013958有望成為肺腺癌潛在生物標志物和治療靶點。

此 外 ，circABCC4［9］、circPRKCI［10］、circRNAENO1［11］、circ-SOX4［12］均在肺腺癌中過表達，都參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，為肺腺癌的早期診斷和早期治療提供了新視角。circRNA不僅在肺腺癌的早期診斷中有幫助，而且在NSCLC的亞分型診斷上亦具 有 重 要 的 潛 力。WANG 等［13］報 道 hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495在肺腺癌和肺鱗癌中差異表達，可以分別作為兩者的診斷/亞型標記物。在肺腺癌的生存預后方面，circRNA亦具有潛在意義。如circ_0001946的表達與肺腺癌的TNM分期、腫瘤直徑呈正相關，與患者的總體存活率呈負相關，有望成為預后評估的靶點［14］?？梢?，circRNA在肺腺癌的早期診斷、早期治療及預后評估中具有潛在的臨床意義。

1.2 生物學作用 已有較多證據顯示，circRNA在肺腺癌的增殖、凋亡、侵襲、轉移［4］和分化等生物學過程中起作用。肺腺癌中的circRNA主要扮演兩大角色，一是充當癌基因發(fā)揮致癌作用，二是發(fā)揮抑癌作用。

1.2.1 致癌作用 目前的研究顯示，與癌癥相關的circRNA在功能上被證實較多的是其致癌作用，證明circRNA驅動癌癥進展。實時熒光定量PCR技術檢 測 顯 示 ，hsa_circ_0013958［8］、circ ABCC4［9］、circRNA-ENO1［11］、hsa_circ_0025036［15］等 在 肺 腺 癌 組織及細胞系中過表達，均能促進肺腺癌細胞的增殖、遷 移 ，并 抑 制 其 凋 亡 。 hsa-circ-0000211［16］、circ TSPAN4［17］、circ-CAMK2A［18］在肺腺癌中表達上調，促進腫瘤細胞侵襲和轉移，從而調控肺腺癌的進展。此外，has-circRNA-002178［19］能增加肺腺癌細胞的腫瘤免疫逃逸能力，促進腫瘤的生長和轉移?？梢?，circRNA在肺腺癌中充當癌基因影響腫瘤的進展。

1.2.2 抑癌作用 大部分circRNA在肺腺癌中過表達并發(fā)揮致癌作用，少部分通過下調表達而發(fā)揮抑癌作用。較早在肺癌細胞中發(fā)現(xiàn)的circRNAITCH［20］可作為腫瘤抑制因子，通過增強其親本基因ITCH的表達而抑制肺癌細胞的增殖。YU等［21］采用實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，circRNA cMras在肺腺癌組織中呈低表達，且在體外細胞系（A549、H1975和H1299）中表達也被下調，并證實了circRNA cMras抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，證明其潛在的抑癌功能。體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，circCRIM1在H1299、pc9和H2228細胞系表達下調最明顯，且Transwell和Matrigel分析顯示circ-CRIM1抑制肺腺癌細胞的侵襲和轉移［22］。最近的研究也證明，circ_0006427可以逆轉肺腺癌上皮間充質轉化，抑制細胞的增殖、遷移和侵襲，并且在動物實驗中進一步證明了circ_0006427的過度表達可抑制腫瘤的生長［23］。諸多研究顯示，circRNA可以抑制肺腺癌細胞的生長、轉移和上皮間充質轉化，發(fā)揮抑癌作用。

2 circRNA在肺腺癌中的作用機制

2.1 microRNA（miRNA）海綿吸附作用 miRNA是基因表達的重要轉錄后調節(jié)因子，它通過直接堿基配對作用于mRNA的非翻譯區(qū)內的靶位點，從而抑制轉錄后基因表達。而circRNA作為一種特殊的具有競爭性的內源性RNA，富含miRNA結合位點，它主要通過與miRNA結合，從而阻礙miRNA與mRNA的結合，最終抑制miRNA的功能或降低miRNA的活性。如ciRS-7被證明具有76個miR-7結合位點［24］，可抑制miR-7的活性而影響阿格蛋白（AGO）的表達。目前在肺腺癌的眾多研究中，熒光素酶測定顯示circRNA的作用機制主要是充當miRNA海綿，該機制不僅參與circRNA對肺腺癌的致癌、抑癌過程，而且貫穿于circRNA誘導肺腺癌細胞發(fā)生藥物抵抗的始終。其中hsa_circ_0012673通過抑制靶向erb-b2受體酪氨酸激酶3（ErbB3）的miR-22而促進肺腺癌細胞的增殖［25］。circABCC4通過miR-3186-3p/TNRC6B軸促進肺腺癌的增殖、遷移，并抑制細胞凋亡［9］。circ_0001946通過使miR-135a-5p海綿化從而上調SIRT1并激活Wnt/β-catenin信號通路來促進肺腺癌進展［14］。另外，circRNA cMras和circCRIM1分別充當miR-567、miR-182的海綿來抑制肺腺癌的生長和轉移。hsa_circ_0003998通過抑制miR-326的表達而增加肺腺癌的耐藥性，可作為潛在的化學抗性啟動子［26］。以上研究均表明circRNA通過海綿吸附miRNA而發(fā)揮作用。

2.2 調節(jié)蛋白表達 circRNA可以直接或間接與相應蛋白結合形成RNA-蛋白復合物，進而發(fā)揮調節(jié)作用。CHEN等［27］報道，circRNA與蛋白的關系類似于與miRNA的“海綿”特性，可以利用特定區(qū)域與某些蛋白質相互作用，充當蛋白質“海綿”。如circRNA與AGO、盲肌蛋白（MBL）等結合進而調節(jié)RNA結合蛋白［24-28］，最終參與細胞增殖、分化、凋亡等過程。雖然此方面有關肺腺癌研究甚少，但已有研究顯示circ-MTO1過表達可以提高RNA結合蛋白QKI-5的表達，而QKI-5表達增加反過來又促進了circ-MTO1表達，兩者過表達協(xié)同下調miR-17的表達，從而抑制肺腺癌的生長，為肺腺癌的分子機制研究提供了新見解［29］。另外 hsa_circ_0013958通過miR-134的海綿間接上調細胞周期蛋白D1，從而促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展［8］。

2.3 調控基因轉錄 事實證明，在細胞核中的circRNA能與RNA聚合酶形成轉錄復合體來參與基因的表達調控，如來源于內含子的ciRNA可以逃離脫支酶的分解作用，并與RNA結合酶Ⅱ相互作用，從而正向調節(jié)基因轉錄［30］。如circRNA circ-DONSON依賴轉錄因子SOX4的NURF復合物促進胃癌的生長和侵襲［31］。而QIU等［10］在研究circPRKCI促進肺腺癌生長時發(fā)現(xiàn)，轉錄因子E2F7是circPRKCI的下游目標，circPRKCI的過表達會增加E2F7轉錄因子的蛋白質水平，反之亦然。先前眾多研究表明，烯醇化酶1（ENO1）［32］作為一種糖酵解酶，可通過調節(jié)腫瘤糖酵解而影響腫瘤進展。而ZHOU等［11］在肺腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，ENO1是circ-ENO1的宿主基因，circ-ENO1調控ENO1的轉錄，沉默circ-ENO1可以降低ENO1的表達并導致烯醇酶活性和乳酸生成降低，表明circ-ENO1調節(jié)ENO1的表達以調節(jié)肺腺癌細胞中的糖酵解，從而促進肺腺癌的進展。

2.4 調節(jié)細胞自噬 自噬是一種自我降解和再循環(huán)的過程，它在保持細胞體內的平衡發(fā)揮重要作用，并與多種形式的人類疾?。òò┌Y）有關［33］。研究發(fā)現(xiàn) circHIPK2［34］、circHECTD1［35］能誘導星形膠質細胞的自噬而使其活化，從而影響缺血性腦卒中。hsa_circ_0023404［36］抑制自噬介導的細胞凋亡而增強宮頸癌細胞對順鉑的化學耐藥性。但自噬是促進還是抑制腫瘤形成一直是爭論的話題。DU等［37］發(fā)現(xiàn)circ-DNMT1通過促進p53的核轉位誘導細胞自噬來增強乳腺癌進展。但有研究發(fā)現(xiàn)，在突變型STK11肺腺癌細胞系（A549和 H838）中，沉默circHIPK3［38］能誘導肺腺癌細胞系的自噬而抑制癌細胞的生長。目前，circRNA與自噬的關系在肺腺癌中的研究相對較少，有待進一步挖掘和探討。

2.5 利用外泌體的功能 外泌體是一種直徑30～100 nm的小囊泡，具有脂質雙層膜結構，在血漿、血清、唾液和尿液等廣泛存在［39］。這些囊泡包含蛋白質、脂質、miRNA、長鏈非編碼RNA（lncRNA）和circRNA，它們在維持生理狀態(tài)和疾病進展中具有重要功能［39-40］。據報道，外泌體在細胞內攜帶和傳遞致癌分子，作為致癌物的信使在腫瘤的進展中起著至關重要的作用［39］。已有研究證實，在外泌體中有大量circRNA存在，其可以促進胰腺癌［40］、胃癌［41］、大腸癌［42］的發(fā)生發(fā)展。CHEN等用高通量測序法全面分析了5對肺腺癌患者和健康人的血漿外泌體circRNA表達譜，鑒定出182個差異表達的外泌體circRNA，其中 hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0001346表達上調，可能是肺腺癌的新型潛在早期診斷標志物。最近WANG等［19］也發(fā)現(xiàn)circRNA-002178高表達于肺腺癌患者血漿的外泌體中，它利用外泌體的功能通過miR-28-5p傳遞信號到CD8+T細胞中以促進程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）的表達，避免了免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，從而促進肺腺癌的生長和轉移，且可作為肺腺癌早期診斷的生物標志物。

2.6 與lncRNA相互作用 越來越多的研究證明，circRNA和lncRNA與人類疾病密切相關，尤其是對癌癥（包括肺癌）的促進或抑制作用。雖然兩者在生物學功能和應用上有一定的區(qū)別，但是兩者具有較多的共同點，circRNA和lncRNA都含有可翻譯為功能性小肽的短開放閱讀框，都能編碼蛋白，都可以通過海綿miRNA促進癌癥或抑制癌癥的發(fā)生［43-44］。那么兩者在腫瘤的發(fā)生中是否產生協(xié)同或拮抗作用，這值得關注和思考。有學者提出circRNA和線性RNA的形成共享一些常見的外顯子，它們可能彼此競爭［45］。CHEN 等［38］在肺腺癌中研究證實 circHIPK3和線性HIPK3（linHIPK3）在自噬調節(jié)方面產生拮抗作用，還證明了circHIPK3和linHIPK3兩者之間的比例（C∶L）能夠反映癌細胞的自噬水平，并提出較高的C∶L值（＞0.49）預示患者預后不良，說明circRNA和lncRNA在癌癥的分子機制中有一定的競爭關系。再如circRNA-ITCH在肺癌［20］和卵巢癌［46］中均表達下調，但最近的研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中circRNA-ITCH與lncRNA呈負相關，兩者產生拮抗作用，最后證實circRNA-ITCH通過下調lncRNA HULC表達而抑制卵巢癌的增殖。在肺腺癌中circRNA-ITCH與lnRNA是否也是對立關系，有待進一步研究。

3 circRNA與肺腺癌耐藥性的相關性

盡管靶向治療和免疫治療為肺腺癌的治療帶來很大的希望，也得到不斷改善和發(fā)展，但是腫瘤的耐藥性仍然存在。越來越多的研究證明，部分circRNA能夠抵抗化療藥物而影響患者的預后。如circFGFR1不僅促進NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲，且通過海綿miR-381-3p上調CXCR4表達而發(fā)揮其免疫抑制作用，使NSCLC細胞中的CD8+T細胞減少，從而增強了NSCLC細胞對PD-1抗體免疫治療的抗藥性［3］。

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼、依科替尼和埃洛替尼等，為NSCLC治療的關鍵，有必要對其耐藥機制進行深入研究。JOSEPH等［47］發(fā)現(xiàn) cirRNA CCDC6在肺腺癌及 EGFR 耐藥H1975細胞系中均高表達，其在肝細胞生長因子及其受體的調節(jié)下可增加肺腺癌細胞對吉非替尼、埃洛替尼的耐藥性，為化療藥物治療提供了靶標。MAO 等［48］在 104例肺腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，circRNA CDR1-AS的表達與患者新輔助化療（培美曲塞和順鉑）呈正相關，與生存時間呈負相關，還證實了CDR1-AS在對培美曲塞（PTX）和順鉑（CDDP）耐藥的肺腺癌組織和細胞系（A549/CR）中過表達，藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)CDR1-AS能誘導肺腺癌細胞對PTX和CDDP的抵抗。另外，在肺腺癌組織和對多西他賽耐藥細胞系（A549/DTX和H1299/DTX）中hsa_circ_0003998［26］表 達 也 上 調 ，敲 低 hsa_circ_0003998可以降低肺腺癌細胞對多西他賽的化學耐藥性。由此可見，circRNA在調節(jié)多種化療藥物敏感性方面發(fā)揮重大作用，有望成為化療藥物耐藥研究的突破點。

4 問題和展望

越來越多的證據顯示，circRNA的異常表達可促進或抑制肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，并在調節(jié)藥物耐藥性方面發(fā)揮重要作用，可作為肺腺癌早期診斷和治療的潛在生物標志物。但是目前對circRNA的研究仍處于初始階段。第一，自然界中已發(fā)現(xiàn)數以千計的circRNA，但在肺腺癌中僅對少部分circRNA進行了研究，且樣本量有待擴大，還有更多的circRNA及其相關機制需要去挖掘；第二，circRNA在肺腺癌中的作用機制尚未研究成熟，目前多數學者主要研究circRNA的miRNA海綿吸附作用，而circRNA對蛋白的編碼功能研究甚少，且circRNA與自噬、外泌體和lnRNA的關系亦有待進一步研究；第三，已證實circRNA可以被分泌到細胞外環(huán)境中，方便提取，這為臨床診斷和治療提供了新策略。但目前所發(fā)現(xiàn)的circRNA，仍處于基礎研究中，還未完全投入臨床實踐，尤其是在肺癌的靶向治療方面有待進一步深入。

盡管目前對circRNA生物學作用及機制的研究還有限，但隨著生物技術的發(fā)展，以及人類對circRNA研究的不斷探索，可能會發(fā)現(xiàn)更多與肺腺癌相關的circRNA，對其生物學發(fā)病機制將會更加明確，為肺腺癌的診斷和治療提供更新的視角和更好的策略。