長(zhǎng)鏈非編碼RNA NORAD對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的影響及機(jī)制

趙曉雪，張冰玉，劉宇翔

遼寧省金秋醫(yī)院綜合老年醫(yī)學(xué)科三病房，沈陽110016

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是全球發(fā)病和死亡的首要原因，但目前為止其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。已知的公認(rèn)發(fā)病機(jī)制包括代謝紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、免疫反應(yīng)異常以及慢性動(dòng)脈壁炎癥等。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS病變的首要步驟，可以通過對(duì)一氧化氮的生物利用度、縮血管物質(zhì)生成、血小板聚集、趨化因子生成、單核細(xì)胞貼壁等方面的影響，最終導(dǎo)致AS的發(fā)生及進(jìn)展［1］。AS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及因素較多，因此探索新的機(jī)制仍具有迫切性和現(xiàn)實(shí)意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）能夠通過修飾和調(diào)控編碼基因的轉(zhuǎn)錄，直接與蛋白質(zhì)或編碼蛋白本身結(jié)合，從而影響多種生物學(xué)過程?，F(xiàn)有研究顯示lncRNA在心肌梗死、心力衰竭、心肌肥厚、心律失常等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，顯著影響患者的預(yù)后和生存［2］。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA將成為一種有前景的藥物治療靶點(diǎn)。lncRNA NORAD可以維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定，與腎癌、淋巴瘤等的不良預(yù)后有關(guān)，但在AS發(fā)病過程中的作用仍不明確。本課題組在2020年6月—11月，對(duì)NORAD與AS之間的關(guān)系進(jìn)行了初步研究，通過觀察NORAD對(duì)氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的調(diào)控作用，探討其對(duì)AS的影響及潛在分子機(jī)制，為疾病的診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購自上海中喬新舟生物科技有限公司，ox-LDL購自北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司，Opti-MEM購自美國(guó)GIBCO公司，Powder瓊脂糖購自法國(guó)Biowest公司，F(xiàn)astDigest BamHI、FastDigest HindⅢ購自上海Thermo Scientific公司，Lipofectamine2000購自美國(guó)invitrogen公司，質(zhì)粒大量制備試劑盒、TRIpure、Super M-MLV 反 轉(zhuǎn) 錄 酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix購自北京BioTeke生物技術(shù)有限公司，SYBR Green購自德國(guó)Sigma公司，Western及IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和其他Western blotting試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，核因子κB p65（NF-κB p65）與磷酸化核因子κB抑制蛋白（p-IκBα）購自Abclonal公司，山羊抗兔IgG購自beyotime公司，Histone H3購自proteintech公司，β-actin購自BOSTER公司，白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）的ELISA檢測(cè)試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 HUVECs的培養(yǎng)與ox-LDL處理 將HUVECs接種于6孔板中，分為陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3，用含20%胎牛血清的M199完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁換用無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理HUVECs 1 h，各組分別加入0、50、100、200 μg/mL的ox-LDL，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 質(zhì)粒載體構(gòu)建 根據(jù)人NORAD的序列，設(shè)計(jì)shRNA退火引物并合成共50μL的反應(yīng)體系進(jìn)行引物退火。利用質(zhì)粒大量制備試劑盒提取目的質(zhì)粒。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳檢測(cè)。退火產(chǎn)物與雙酶切后的干擾載體片段連接。連接產(chǎn)物加入至感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Amp的瓊脂平板上培養(yǎng)，形成單菌落。挑選菌落，鑒定插入的片段，選取陽性克隆，制備菌保送測(cè)序。1.4 HUVECs的轉(zhuǎn)染 將HUVECs接種于6孔板，分為陰性對(duì)照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組。培養(yǎng)待貼壁。用Opti-MEN培養(yǎng)基分別稀釋Lipofectamine2000、shNORAD和shNC。將已稀釋的Lipofectamine2000溶液分別與shNORAD（NORAD的干擾RNA）、shNC（非特異性的干擾RNA）溶液混勻，室溫孵育20 min，待用。參照Lipofectamine2000試劑盒說明書，ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組分別轉(zhuǎn)染shNC、shNORAD，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組加入200μg/mL的ox-LDL處理24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 HUVECs內(nèi)NORAD表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。用TRIpure試劑分別提取1.2與1.4中各組HUVECs的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣本的RNA濃度，計(jì)算逆轉(zhuǎn)錄所需的RNA體積。保證RNA上樣量一致，以O(shè)ligo（dT）15和Random為引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以得到相應(yīng)的cDNA。PCR的反應(yīng)體系為20μL，其中包括1μL的cDNA模板，各0.5μL的上下游引物。lncRNA NORAD正向引物序列5'-GGAGAATCGCTTGAACT-3'，反向引物序列5'-CAAACACCCAATGAATAG-3'；β-actin正向引物序列5'-GGCACCCAGCACAATGAA-3'，反向引物序列5'-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3'。反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 15 s變性，60℃ 25 s退火，72℃30 s延伸。用2-ΔΔCt法計(jì)算NORAD相對(duì)表達(dá)量。

1.6 HUVECs內(nèi)NF-κB p65、p-IκBα表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。分別收集1.2與1.4中各組的HUVECs，用細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解樣本。開啟冷凍離心機(jī)，12 000 r/min 4℃離心10 min，分離上清即為蛋白質(zhì)提取物。BCA法測(cè)量提取的每組蛋白濃度。制備蛋白上樣液，每孔含40μg蛋白。用SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜。用TBST緩沖液配制5%脫脂奶粉，將PVDF膜置于脫脂奶粉中封閉1 h。在雜交袋內(nèi)放入配制好的NF-κB p65、p-IκBα抗體工作液與封閉的PVDF膜，4℃過夜，孵育一抗。取出PVDF膜，TBST洗膜4次，每次5 min。然后將PVDF膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗共同于室溫下孵育45 min。再次TBST洗膜6次，每次5 min。ECL化學(xué)發(fā)光試劑浸濕PVDF膜，暗室曝光。用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 HUVECs內(nèi) IL-6、TNF-α、ICAM-1檢測(cè) 采用ELISA法。用包被液稀釋包被抗體至濃度為10μg/mL，4℃包被過夜。用PBST將IL-6、TNF-α與ICAM-1標(biāo)準(zhǔn)品分別從1 000 pg/mL開始做倍比稀釋，濃度分別為 500、250、125、62.5、31.25、15.6 pg/mL。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品各100μL，依次加入96孔板中，空白孔內(nèi)加入1×PBST，樣本孔內(nèi)分別加入100μL陰性對(duì)照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組的待測(cè)樣本，37℃孵育2 h。甩掉孔內(nèi)的液體，加入捕捉抗體100μL，37℃孵育1 h。用PBST洗板3次，每次2 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素100μL，37℃孵育30 min。用PBST洗板5次，每次2 min。每孔內(nèi)加入100μL的TMB顯色液，37℃孵育15 min后加入終止液。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的各孔OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)不同樣本的OD值計(jì)算出相應(yīng)的樣本濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ox-LDL處理后HUVECs內(nèi)NORAD的表達(dá)變化 陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3 NORAD的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.05、1.41±0.03、3.19±0.06、3.95±0.22，陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3相比，實(shí)驗(yàn)組2與實(shí)驗(yàn)組3相比，P均＜0.05。

2.2 不同濃度ox-LDL處理HUVECs后NF-κB通路的變化 陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3 NF-κBp65的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00± 0.04、1.90±0.05、2.98± 0.06、4.08± 0.03，p-IκBα的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.02、1.66±0.05、3.15±0.07、3.53±0.04，組間兩兩相比P均＜0.05。選擇200μg/mL作為后續(xù)試驗(yàn)的ox-LDL濃度。

2.3 shNORAD的轉(zhuǎn)染效率 陰性對(duì)照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組中NORAD的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.02、4.01±0.21、3.94±0.16、0.76±0.01，ox-LDL+shNORAD組與ox-LDL+shNC組相比P＜0.05。

2.4 NORAD對(duì)NF-κB通路的調(diào)控作用 陰性對(duì)照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組中NF-κB p65的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.05、3.93 ± 0.03、4.04 ± 0.04、3.05 ± 0.05，p-IκBα的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.02、3.60±0.08、3.49±0.09、2.89±0.06，ox-LDL+shNORAD組與ox-LDL+shNC組相比P＜0.05。

2.5 NORAD對(duì)HUVECs分泌功能的調(diào)控作用 陰性對(duì)照組、ox-LDL組、ox-LDL+shNC組、ox-LDL+shNORAD組中IL-6水平分別為（52.53±0.31）、（215.40 ± 0.39）、（218.30 ± 0.45）、（203.60 ±0.38）pg/mL，TNF-α水平分別為（45.75± 0.29）、（172.70 ± 0.34）、（168.40 ± 0.34）、（160.80 ±0.41）pg/mL，ICAM-1水平分別為（92.36± 0.65）、（318.20 ± 0.33）、（315.30 ± 0.33）、（297.90 ±0.83）pg/mL，陰性對(duì)照組與ox-LDL組相比，ox-LDL+shNORAD組與ox-LDL+shNC組相比，P均＜0.05。

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、氧化應(yīng)激和慢性炎癥共同誘發(fā)并維持AS的病變過程［3］。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙發(fā)生在AS的早期，表現(xiàn)為抗炎、抗凝功能的變化以及調(diào)節(jié)血管舒縮能力的受損。而ox-LDL可以通過多種機(jī)制促進(jìn)AS斑塊的形成和發(fā)展，包括誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。ox-LDL可以介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的活化，通過上調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白1、IL-8、E-選擇素、血管間黏附分子等趨化因子和黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)循環(huán)單核細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮。ox-LDL可以減少內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管舒張劑一氧化氮；通過消耗質(zhì)膜微囊內(nèi)的膽固醇取代內(nèi)皮型一氧化氮，抑制一氧化氮的生成；以及促進(jìn)活性氧的生成，滅活一氧化氮。ox-LDL還能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ等血管收縮因子。ox-LDL激活caspase-9、caspase-3及Fas等凋亡因子，降低凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促使血管對(duì)細(xì)胞和脂質(zhì)的通透性增加。ox-LDL還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生成更多的ROS，介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)［4］。研究顯示，NF-κB信號(hào)通路與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙之間存在著關(guān)系。替格瑞洛和氯吡格雷可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路，減輕LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［5］。另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示，富組氨酸糖蛋白通過抑制NF-κB信號(hào)通路的活性，減少TNF-α/LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能［6］?？傊瓵S的治療目前仍以調(diào)脂、預(yù)防血栓形成為主。但由于其發(fā)病機(jī)制是多方面的，當(dāng)前的針對(duì)性治療尚不能覆蓋所有方面。進(jìn)一步深入研究AS的發(fā)病機(jī)制，為治療提供新的靶點(diǎn)和策略是臨床醫(yī)生的關(guān)注重點(diǎn)。lncRNA由于能夠在表觀遺傳學(xué)水平上調(diào)控多種疾病的病理生理過程，其與AS的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)。

隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展，人們逐漸意識(shí)到大約98%的基因組轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA。這些轉(zhuǎn)錄本中，長(zhǎng)度超過200個(gè)堿基對(duì)的被稱為lncRNA。lncRNA雖然無法編碼蛋白質(zhì)，但是越來越多的證據(jù)表明其在細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)、凋亡以及基因表達(dá)模式的改變中起著關(guān)鍵作用［7-9］。lncRNA參與了多種心血管疾病的發(fā)病過程。lncRNA TCONS-00106987通過內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)miRNA-26，誘導(dǎo)其靶基因KCNJ2的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)電重構(gòu)，從而增加內(nèi)向整流K＋電流，縮短心房有效不應(yīng)期，誘導(dǎo)房顫的發(fā)生［10］。lncRNA也參與了對(duì)缺血性心臟病的調(diào)節(jié)，F(xiàn)OXO3a通過促進(jìn)lncRNA LINC00261的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)miR-23b-3p的表達(dá)，提高NRF2的水平，減輕了缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，改善了心功能［11］。lncRNA可通過多個(gè)方面調(diào)控AS的病理過程。CHI等［12］發(fā) 現(xiàn)，沉 默 lncRNA HOXA-AS3可 以 通 過 調(diào)控miR-455-5p/p27 Kip1軸，減輕ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)抑制以及G1周期阻滯，從而抑制AS的進(jìn)展。而另一lncRNA PEBP1P2則通過與CDK9結(jié)合，抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和去分化，減輕AS病變［13］。目前為止有關(guān)lncRNA與AS之間關(guān)系的研究仍十分有限，進(jìn)一步的機(jī)制研究很有必要。本實(shí)驗(yàn)試圖從lncRNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的影響入手，揭示lncRNA對(duì)AS病理生理變化的影響。

NORAD通過阻斷PUMILIO蛋白的作用來維持基因組的穩(wěn)定性。由于其獨(dú)特的特性，很快便成為研究的焦點(diǎn)。后續(xù)的研究表明，NORAD在不同類型的癌癥中處于功能失調(diào)狀態(tài)，并與癌癥發(fā)生發(fā)展的幾個(gè)關(guān)鍵過程有關(guān)，如細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡［14-15］。由于lncRNA參與了多種心血管疾病的病理生理過程，本實(shí)驗(yàn)擬探討lncRNA NORAD在AS過程中的作用及潛在的分子機(jī)制。由于氧化應(yīng)激反應(yīng)是AS重要的始動(dòng)和維持因素，因此本實(shí)驗(yàn)首先用ox-LDL構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，分別用 0、50、100、200μg/mL四種不同濃度的ox-LDL處理HUVECs 24 h。之后的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著ox-LDL濃度的升高，NORAD在HUVECs中的表達(dá)也逐漸上調(diào)。由于NF-κB通路的異常與腫瘤、免疫反應(yīng)、炎癥等疾病相關(guān)，且其也參與了AS的過程。本實(shí)驗(yàn)接下來驗(yàn)證NF-κB通路在氧化應(yīng)激情況下的變化，結(jié)果顯示HUVECs中 NF-κB 通路的關(guān)鍵因子 NF-κB p65與p-IκBα的表達(dá)也隨著ox-LDL濃度的增加而上調(diào)。因此選擇了200μg/mL的ox-LDL繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。NORAD 可 參 與 NF-κB 信 號(hào) 通 路 的 調(diào) 節(jié)［16］，推 測(cè)NORAD可能通過對(duì)NF-κB通路的調(diào)節(jié)，影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。為了證實(shí)上述的假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了shNORAD質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)染HUVECs以下調(diào)NORAD的表達(dá)，經(jīng)過200μg/mL的ox-LDL處理后，與非特異性序列shNC轉(zhuǎn)染的HUVECs相比，ox-LDL+shNORAD組NF-κB p65與p-IκBα表達(dá)下調(diào)。提示NORAD表達(dá)下調(diào)抑制了NF-κB通路的活性。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的表現(xiàn)之一為趨化因子、炎癥因子分泌的異常。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，與陰性對(duì)照組相比，ox-LDL組HUVECs分泌的IL-6、TNF-α、ICAM-1水平升高，提示氧化應(yīng)激加重了內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。轉(zhuǎn)染后，與ox-LDL+shNC組相比，ox-LDL+shNORAD 組 HUVECs分泌的 IL-6、TNF-α、ICAM-1水平降低，提示在氧化應(yīng)激的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙得到了部分的逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，lncRNA NORAD表達(dá)下調(diào)可以減少氧化應(yīng)激情況下內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子與炎癥因子，其可能是通過抑制NF-κB通路的活性發(fā)揮作用，可能成為AS新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。