胰腺癌PDX模型研究進(jìn)展

盧彧，任學(xué)晨，周成亮，陳昊，康迎新，樊勇，康博雄，劉永永，王琛

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，蘭州730030

近年來，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國胰腺癌的死亡率在所有惡性腫瘤中居第六位［1］。雖然胰腺癌的治療取得了很大進(jìn)展，但在消化系統(tǒng)腫瘤中其總體生存率仍然較低［2］。胰腺癌預(yù)后不良與其基因組的復(fù)雜性、異質(zhì)性以及難以早期診斷和缺乏有效治療方案等有關(guān)。因此，深入研究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，對(duì)提高其診療水平具有重要意義。目前，對(duì)胰腺癌的研究依賴高擬合度的臨床前模型，如細(xì)胞系移植模型、基因工程動(dòng)物模型、類器官模型等。但這些模型并不能準(zhǔn)確反映胰腺癌的形態(tài)學(xué)、病理學(xué)以及增殖、侵襲等生物學(xué)行為，更不能模擬胰腺癌的基因組特征。近年通過活組織檢查或手術(shù)切除獲得的人類腫瘤組織，可直接植入免疫缺陷嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)而產(chǎn)生人源腫瘤異種移植（PDX）模型。PDX模型有可能成為胰腺癌臨床前研究和藥物篩選的首選模型。本文結(jié)合文獻(xiàn)就胰腺癌PDX 模型的研究進(jìn)展作一綜述。

1 胰腺癌PDX模型制備

1.1 胰腺癌PDX 模型制備方法 胰腺癌PDX 模型的制作過程［3］：通過手術(shù)或組織活檢獲取原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性胰腺癌組織片段，即刻冷凍保存；移植前將胰腺癌組織分割成1～4 mm3碎片，嵌入少量基質(zhì)膠后植入免疫缺陷小鼠的原位或皮下?；|(zhì)膠是一種可溶性的類基底膜基質(zhì)，可為胰腺癌細(xì)胞在接受宿主營養(yǎng)供給之前提供充足的生長條件。因此，裹有基質(zhì)膠的腫瘤細(xì)胞比單純的腫瘤細(xì)胞更易種植且更快成瘤。在第一代免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立的PDX 組織被切成片段，一部分重新植入新的宿主中，以供下一代使用；一部分冷凍保存，后期驗(yàn)證傳代腫瘤在形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)上的保守性。胰腺癌PDX 模型制備成功率為40%～80%［4-8］。從胰腺癌組織接種至收獲一般需要2～4 個(gè)月，超過6 個(gè)月仍未發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤組織即認(rèn)為植入失敗［4］。皮下種植的腫瘤可通過觸診測量，原位或轉(zhuǎn)移部位的腫瘤可通過影像學(xué)監(jiān)測［5］。研究一般從第3 代（F3）PDX 開始，多數(shù)采用F3～F10 PDX 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［6］。不同胰腺癌患者PDX 移植的成功率不同。有研究認(rèn)為，PDX 移植成功率與胰腺癌腫瘤大小、惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管侵犯以及是否經(jīng)過化療等因素有關(guān)［4-8］。

1.2 制備胰腺癌PDX 模型的小鼠品系 制備胰腺癌PDX 模型可使用胸腺缺失裸鼠、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠、非肥胖糖尿?。∟OD）/SCID 小鼠、NOD/SCID/IL-2 受體γ 缺失（NSG）小鼠等。這些品系的小鼠在免疫抑制和研究效益方面存在差異。胸腺缺失的裸鼠成本最低，但因其具有固有免疫應(yīng)答系統(tǒng)，存在較強(qiáng)烈的宿主抗移植物反應(yīng)，其制備胰腺癌PDX 模型的成功率較低。SCID 小鼠先天性無T、B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育和成熟，獲得性免疫缺失，但仍具有正常的NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞，仍可發(fā)揮固有免疫功能。NOD/SCID 小鼠較SCID 小鼠具有更低的NK 細(xì)胞活性，宿主抗移植物反應(yīng)發(fā)生率更低。NSG 小鼠敲除了IL-2 受體的γ 鏈，是目前免疫缺陷程度最高的工具小鼠，最適合構(gòu)建加入人體免疫系統(tǒng)的PDX 模型。如今的PDX 模型多是通過將獲取的患者腫瘤組織移植入免疫缺陷小鼠（通常是NOD/SCID小鼠或NSG小鼠）構(gòu)建的［4-8］。

2 胰腺癌PDX模型與傳統(tǒng)腫瘤模型比較

胰腺癌基礎(chǔ)研究的臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)展較慢，一個(gè)潛在的因素是研究胰腺癌的動(dòng)物模型不可靠。傳統(tǒng)的胰腺癌臨床前模型主要有細(xì)胞系移植模型和基因工程動(dòng)物模型，相較于胰腺癌PDX 模型，其對(duì)人類胰腺癌基因組和腫瘤微環(huán)境特征的模擬程度明顯不足。

2.1 細(xì)胞系移植模型與胰腺癌PDX 模型比較 首個(gè)人類胰腺癌細(xì)胞系是在1963 年完成的［9］，之后的細(xì)胞系大多是從小鼠或人的腫瘤細(xì)胞中發(fā)展而來。使用細(xì)胞系進(jìn)行研究有許多優(yōu)點(diǎn)，如易操作、成本低、可重復(fù)性高以及能夠進(jìn)行遺傳改變和藥物干預(yù)等。然而細(xì)胞系及其小鼠移植物在胰腺癌的研究中存在一定局限性。第一，許多細(xì)胞系是從侵襲性、轉(zhuǎn)移性腫瘤組織中產(chǎn)生的，通常無法代表原發(fā)腫瘤的初期狀態(tài)和病變特征。第二，細(xì)胞系缺乏其他類型細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、神經(jīng)纖維、免疫細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，無法展示在臨床上腫瘤復(fù)雜的異質(zhì)性［10］；而且細(xì)胞系中存在幾種不同的亞群，在傳代過程中可能會(huì)選擇更具侵襲性的克?。?1］，無法保證研究對(duì)象的同質(zhì)性。第三，細(xì)胞系的反復(fù)傳代會(huì)發(fā)生各種外源性遺傳物質(zhì)污染，或由于優(yōu)勢細(xì)胞的遺傳漂變、自發(fā)或被動(dòng)的拷貝數(shù)變異、點(diǎn)突變等，不可避免地導(dǎo)致細(xì)胞系的遺傳學(xué)改變［12］。實(shí)體腫瘤的組織學(xué)特征，如腫瘤血管的異常結(jié)構(gòu)、功能及致密的細(xì)胞外基質(zhì)等，是藥物輸送的障礙，而胰腺癌PDX 模型具有與原發(fā)腫瘤相似的促結(jié)締組織增生性反應(yīng)和血管分布特征［13］。因此，胰腺癌PDX 模型比細(xì)胞系移植模型更能準(zhǔn)確地模擬人體內(nèi)的藥物傳遞狀態(tài)。

2.2 基因工程動(dòng)物模型與胰腺癌PDX 模型比較 基因工程動(dòng)物模型是由引入小鼠基因組的特定突變引起的，而人類胰腺癌是由多種遺傳改變引起的。因此，基因工程動(dòng)物模型的主要缺點(diǎn)是可能會(huì)丟失人類腫瘤的基因組特征，同時(shí)引入新的未知突變，并且難以鑒定小鼠腫瘤與人類腫瘤的同源程度［14］。此外，基因工程動(dòng)物模型制備昂貴且耗時(shí)，效率相對(duì)低下［14］。不同于基因工程動(dòng)物模型，胰腺癌PDX 模型能夠反映真實(shí)的遺傳特征，避免了研究靶點(diǎn)以外的遺傳改變。同時(shí)，胰腺癌PDX 模型可直接在普通的SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室制備，大大節(jié)省了時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，腫瘤組織來源也相對(duì)容易，一旦種植成功，可以在幾次凍融循環(huán)和傳代后反復(fù)使用。

3 胰腺癌PDX 模型在臨床前和臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用

目前，在臨床前和臨床試驗(yàn)中，胰腺癌PDX 模型在識(shí)別腫瘤標(biāo)志物、臨床前藥物評(píng)價(jià)、臨床精準(zhǔn)化療、胰腺癌轉(zhuǎn)移及神經(jīng)浸潤等研究中廣泛應(yīng)用。

3.1 識(shí)別腫瘤標(biāo)志物 腫瘤標(biāo)志物是指特征性存在于惡性腫瘤細(xì)胞，或由惡性腫瘤細(xì)胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)，或是宿主對(duì)腫瘤的刺激反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物能夠反映惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在惡性腫瘤診斷、預(yù)后判斷、治療反應(yīng)監(jiān)測、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和靶向藥物研發(fā)等方面具有重要作用。目前，胰腺癌的通用腫瘤標(biāo)志物僅有CA19-9［15］。許多研究使用PDX 模型開發(fā)更可靠的胰腺癌生物標(biāo)志物。GARRIDO-LAGUNA 等［16］通過PDX 測序發(fā)現(xiàn)，移植成功率高的PDX 多為SMAD4 基因的突變體，并具有轉(zhuǎn)移性的基因表達(dá)特征和較差的預(yù)后。JIMENO等［17］通過PDX 確定PLK1 能夠反映胰腺癌吉西他濱化療的敏感程度，PLK1高表達(dá)預(yù)示胰腺癌對(duì)吉西他濱的耐藥性增加。DUTTA 等［18］利用PDX 模型跟蹤體內(nèi)丙酮酸的代謝過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在生長較快的PDX模型中丙酮酸還原為乳酸的轉(zhuǎn)化率較高。

3.2 臨床前藥物評(píng)價(jià) 在PDX 模型中進(jìn)行藥物試驗(yàn)，胰腺癌患者的腫瘤標(biāo)本可以種植到多個(gè)動(dòng)物體內(nèi)，能夠在同一腫瘤中進(jìn)行干預(yù)組和對(duì)照組的直接比較?；谶@種優(yōu)勢，PDX 模型已被用于測試藥物療效的研究。RUBIO-VIQUEIRA 等［3］率先使用胰腺癌手術(shù)標(biāo)本的PDX 構(gòu)建了一個(gè)臨床前藥物研發(fā)平臺(tái)，該平臺(tái)能夠用于預(yù)測抗腫瘤藥物的敏感性。KAWAGUCHI 等［19］構(gòu)建了對(duì)吉西他濱化療耐藥的原位胰腺癌PDX模型，并測試了10種藥物的化療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有考比替尼和曲美替尼能夠抑制胰腺癌生長，從而證實(shí)了原位PDX 模型用于胰腺癌個(gè)體化治療的潛力。

PDX 模型還能夠更清楚地反映化療藥物的作用機(jī)制。RICCIARDIELLO 等［20］將胰腺癌PDX 模型根據(jù)對(duì)吉西他濱是否耐藥進(jìn)行分組，并對(duì)兩組mRNA 表達(dá)譜進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGM3 在耐藥PDX 模型中高表達(dá)，表明吉西他濱和PGM3 抑制劑FR054 聯(lián)用能夠達(dá)到更好的抗胰腺癌效果。此外，PDX 模型還被用于研發(fā)針對(duì)胰腺癌的免疫療法。MA 等［21］在胰腺癌PDX 模型中使用抗PD-1 抑制劑和抗OX40 激動(dòng)劑組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合能夠增加胰腺癌中記憶CD4+和CD8+T 細(xì)胞數(shù)量，從而消滅了所有可檢測到的腫瘤細(xì)胞。

3.3 臨床精準(zhǔn)化療 基于前述PDX 模型的優(yōu)勢，這種模型可為特定腫瘤類型設(shè)計(jì)治療方案。有研究報(bào)道，1 例吉西他濱化療耐藥患者的PDX 模型對(duì)絲裂霉素C 敏感，該患者接受絲裂霉素C 化療后保持了3年無病生存狀態(tài)［22］。胰腺癌PDX 模型作為高通量藥物篩選平臺(tái)可用于開發(fā)有效的治療方案。WITKIEWICZ 等［23］使用胰腺癌PDX 模型進(jìn)行高通量藥物篩選，測試超過500 種單一藥物和聯(lián)合藥物方案，發(fā)現(xiàn)了針對(duì)胰腺癌的多種個(gè)體化治療方案。

3.4 其他應(yīng)用 胰腺癌PDX 可用于制備胰腺癌轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤模型。TANAKA 等［24］使用冷凍保存的胰腺癌患者腫瘤組織構(gòu)建了胰腺癌肝轉(zhuǎn)移PDX模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種植成功率與冷凍時(shí)間和Ki-67 指數(shù)有關(guān)，這為研究胰腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制開拓了新的方向。

神經(jīng)浸潤是導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后不良的重要因素。胰腺的自主神經(jīng)在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)生了顯著的病理變化，其具體機(jī)制尚不清楚。PDX 模型能夠很好地解決上述難題［25］。但目前未見胰腺癌神經(jīng)浸潤PDX 模型的報(bào)道，主要是因?yàn)闃?gòu)建胰腺癌原位種植合并神經(jīng)浸潤模型的難度巨大，同時(shí)無法準(zhǔn)確辨認(rèn)合格的神經(jīng)浸潤模型。

4 胰腺癌PDX模型的不足與改進(jìn)

PDX 模型在胰腺癌基礎(chǔ)和臨床研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但胰腺癌PDX 模型耗時(shí)長，可能需要幾個(gè)月才能完成，仍未體現(xiàn)出在疾病進(jìn)展前短時(shí)間內(nèi)指導(dǎo)胰腺癌患者個(gè)體化治療的應(yīng)用價(jià)值，今后還需要將PDX 模型的生成時(shí)間合理優(yōu)化。此外，隨著腫瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，與腫瘤相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞逐漸被小鼠基質(zhì)細(xì)胞取代［26］。今后，胰腺癌PDX 模型的改進(jìn)方向包括PDX 的三維類器官模型，這種模型可進(jìn)一步表征胰腺癌的三維結(jié)構(gòu)和極性，能夠保持原有的腫瘤微環(huán)境［14］。另外，免疫細(xì)胞移植也可能是改善胰腺癌PDX 模型的方向，通過給免疫抑制小鼠過繼人類造血干細(xì)胞來建立人類免疫系統(tǒng)，能夠更有效地研究免疫系統(tǒng)在胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中的作用機(jī)制［27］。

總之，胰腺癌PDX 模型能夠最大程度保留腫瘤的生物學(xué)特征，是胰腺癌臨床前研究和藥物篩選的首選模型，已經(jīng)在識(shí)別腫瘤標(biāo)志物、臨床前藥物評(píng)價(jià)、臨床精準(zhǔn)化療、胰腺癌轉(zhuǎn)移及神經(jīng)浸潤等研究中得到廣泛應(yīng)用。未來還需要將PDX 模型進(jìn)行合理優(yōu)化，進(jìn)一步提高其代表原發(fā)腫瘤特征的潛力，使之成為改善胰腺癌患者預(yù)后的最佳臨床前工具。