中醫(yī)藥干預(yù)對帕金森病細(xì)胞凋亡影響的研究進(jìn)展

李倫甘，胡玉英

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD) 是一類椎體外系疾病，由于黑質(zhì)多巴胺(Dopamine，DA)能神經(jīng)元顯著變性死亡，黑質(zhì)-紋狀體DA能通路變性，紋狀體DA遞質(zhì)水平顯著減低而導(dǎo)致PD患者肌張力增高、動作減少等運(yùn)動癥狀的產(chǎn)生。黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性死亡是多因素交互作用的結(jié)果，許多研究表明細(xì)胞凋亡是DA神經(jīng)元死亡的主要方式[1]。而目前PD的治療以對癥治療為主，主要針對DA減少及功能喪失問題，僅能一定程度緩解臨床癥狀，副作用大且缺乏長期療效，而在PD早期保護(hù)神經(jīng)元，抑制細(xì)胞變性和凋亡，將有助于延緩PD的進(jìn)展。中醫(yī)藥多靶點(diǎn)作用提供了廣泛神經(jīng)保護(hù)作用，在抗細(xì)胞凋亡上具有獨(dú)特優(yōu)勢，現(xiàn)將中醫(yī)藥在抗PD細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展綜述如下。

1 PD細(xì)胞凋亡機(jī)制

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在多細(xì)胞生物體內(nèi)一種自主有序的死亡，對維持機(jī)體組織穩(wěn)態(tài)、器官形態(tài)形成發(fā)育、受損細(xì)胞清除和防御感染至關(guān)重要[2]。細(xì)胞凋亡受多種基因嚴(yán)格調(diào)控，維持正常生命活動，一旦調(diào)控失衡，神經(jīng)元細(xì)胞過度凋亡，將會導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病(如PD等)的發(fā)生。

1.1 細(xì)胞凋亡過程 細(xì)胞凋亡過程受基因精確調(diào)控，在凋亡信號刺激下，細(xì)胞接受凋亡信號，經(jīng)復(fù)雜生化反應(yīng)完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活凋亡基因，并合成各種促凋亡蛋白酶類，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)分解、死亡，而后被巨噬細(xì)胞分解，完成凋亡。許多基因參與細(xì)胞凋亡過程，包括B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)基因家族、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)受體超家族、凋亡蛋白抑制劑、P53基因等。Bcl-2家族是一類重要的凋亡調(diào)控基因，分為抗凋亡基因(如 Bcl-2、Bcl-1、Bcl-xL等)和促凋亡基因(如Bax、Bak、Bad、Bid 等)兩大類[3]。凋亡級聯(lián)反應(yīng)的早期階段主要取決于 Bcl-2 家族促凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡[4]。而Caspase家族的活化是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，通過裂解細(xì)胞功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白使細(xì)胞分解以致凋亡，其包括凋亡啟動因子(Caspase-2、8、9、10)和凋亡執(zhí)行因子(Caspase-3、6、7)，Caspases的激活常常作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[5]。細(xì)胞凋亡途徑包括：線粒體介導(dǎo)途徑(內(nèi)源性途徑)、死亡受體途徑(外源性途徑)。線粒體介導(dǎo)途徑即細(xì)胞在凋亡刺激因子誘導(dǎo)下，線粒體外膜構(gòu)象改變，通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C(Cytochrome c，Cyto c)等釋放至胞漿內(nèi)，激活凋亡蛋白酶活化因子-1(Apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1)并活化Caspase-9，形成由Cyto c、Apaf-1、Caspase-9組成的凋亡小體，激活Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。死亡受體途徑即在細(xì)胞外凋亡信號誘導(dǎo)下，死亡受體(如TNFR1、CD95、DR3等)與相應(yīng)死亡配體(如TNF、CD95L和 Apo-3等)結(jié)合，并通過其膜內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain，DD)募集銜接蛋白，銜接蛋白經(jīng)其死亡效應(yīng)域(Death effector domain，DED)與Procaspase-8形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物(Death-inducing signaling complex,DISC)，激活Caspase-8，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。

1.2 細(xì)胞凋亡與PD相關(guān)性 細(xì)胞凋亡是PD患者黑質(zhì)DA能神經(jīng)元死亡的主要方式，這從PD患者尸檢報(bào)告顯示DA能神經(jīng)元中DNA斷裂和凋亡染色質(zhì)變化，以及凋亡相關(guān)蛋白水平表達(dá)升高得到了證實(shí)[7]。此外，在PD細(xì)胞模型中，抗凋亡蛋白(如 Bcl-2)的過度表達(dá)可抑制DA能神經(jīng)元死亡[8]，以及Caspase抑制劑可以挽救神經(jīng)元的死亡[9]進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)。細(xì)胞凋亡在神經(jīng)性疾病中被進(jìn)行了廣泛的研究，線粒體介導(dǎo)的凋亡被證實(shí)是PD細(xì)胞凋亡的主要途徑。例如，許多機(jī)制包括線粒體DNA缺失、核DNA突變、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)過度積累等導(dǎo)致的線粒體功能障礙觸發(fā)了PD的細(xì)胞凋亡[10]。又如一些與線粒體功能相關(guān)的基因突變，包括Parkin、LRRK2、PINK1 和DJ-1的突變，可導(dǎo)致常染色體遺傳性PD的發(fā)生[11]。因此，干擾或抑制凋亡途徑是防止DA能神經(jīng)元丟失及PD發(fā)病的一種有效治療策略。

2 PD細(xì)胞凋亡的中醫(yī)藥干預(yù)

中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)整體治療，作用機(jī)制復(fù)雜，中藥多成分的特點(diǎn)使中藥治療具有多途徑、多靶點(diǎn)作用。過去10年的PD體外模型研究中，無論是中藥單藥、中藥復(fù)方還是針灸治療，在抗PD細(xì)胞凋亡方面取得了顯著的成果。

2.1 單味中藥治療 在采用單味中藥干預(yù)MPP+誘導(dǎo)的PD體外模型-SH-SY5Y細(xì)胞或MES23.5細(xì)胞模型的研究中，鉤藤提取物(Uncaria rhynchophylla extract,URE)能呈劑量依賴性增加SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞活力，并通過提高Bcl-2、P-ERK等抗凋亡蛋白表達(dá)，降低Bax表達(dá),進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡[12]。葛根素通過升高了MDM2和Bcl-2 的mRNA的表達(dá)水平，抑制P53、Bax及Caspase-3 的mRNA的表達(dá)，發(fā)揮了對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用[13]。管花肉蓯蓉納米顆粒(肉蓯蓉成分)能改善MES23.5DA能神經(jīng)元細(xì)胞毒性，增加酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)及Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)，減少DA能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[14]。而在采用魚藤酮制備的PC12細(xì)胞或SH-SY5Y細(xì)胞模型研究中發(fā)現(xiàn)，蟲草素(北冬蟲夏草成分)能明顯提高PC12細(xì)胞的存活率，其機(jī)制主要是通過下調(diào)Caspase-8及Fas蛋白的表達(dá)，從而抑制Caspase-3的激活，減少PC12細(xì)胞凋亡[15]。白藜蘆醇(虎杖成分)通過激活去乙?；窼IRT1抑制P53表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)神經(jīng)元存活[16]。研究表明，芍藥苷可以通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位以及提高Bcl-2表達(dá)水平、降低Bax表達(dá)水平，對PC12細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17]。此外，在6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型的研究中發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)可顯著逆轉(zhuǎn)PC12細(xì)胞活力下降，減緩ROS和一氧化氮的積累，降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，通過其抗氧化作用以劑量依賴的方式降低凋亡細(xì)胞的百分比[18]。在采用MPTP誘導(dǎo)PD小鼠模型研究中，不同劑量人參皂苷Rg1(人參成分)預(yù)處理可以下調(diào)PD小鼠黑質(zhì)中Caspase-3的表達(dá)，上調(diào)Bcl-xL的表達(dá)，抑制黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡[19]。另外，在何首烏相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，其提取物(2,3,5,4′-Tetrahydroxystilbene-2-0-β-D-glucoside，TSG)既可以通過抑制ROS生成和調(diào)節(jié)JNK和PI3K/Akt通路的活化抑制PC12細(xì)胞凋亡[20]；也可以顯著上調(diào)Bcl-2/Bax比值，逆轉(zhuǎn)Cyto c釋放，抑制Caspase-3活化[21]，進(jìn)而對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞或SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

2.2 中藥復(fù)方治療 由于PD的病因病機(jī)復(fù)雜多樣，單味中藥神經(jīng)保護(hù)作用具有局限性，而中藥復(fù)方能明顯彌補(bǔ)其不足。中藥復(fù)方在融合多種藥物療效基礎(chǔ)上發(fā)揮多靶點(diǎn)作用，治法上多以補(bǔ)益肝腎法、平肝熄風(fēng)法、活血化瘀法為主，療效顯著。

2.2.1 補(bǔ)益肝腎法:在采用6-OHDA誘導(dǎo)的PD 大鼠模型中，復(fù)方地黃方預(yù)處理既可通過調(diào)控GSK3β信號通路，緩解下游蛋白激活，減弱α-突觸核蛋白 (α-Synuclein，α-syn)異常聚集和錯(cuò)誤折疊，抑制細(xì)胞凋亡[22]，也可以通過激活PI3K/Akt信號通路呈劑量依賴性降低Bax蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡指數(shù)[23]。在采用MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型研究中，加減地黃飲子湯可以減少TH的丟失，有效改善小鼠的行為障礙，并通過調(diào)節(jié)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路中Caspase-12蛋白的表達(dá)，阻斷細(xì)胞凋亡[24]。健脾益腎通絡(luò)方則可以通過NF-κB通路降低Caspase-3 蛋白表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡[25]。補(bǔ)腎方蓯蓉精也可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白，阻止磷脂酰絲氨酸的外化，預(yù)防MPP+所致細(xì)胞凋亡[26]。此外，補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針治療能使蛋白酶抑制因子(PSI)誘導(dǎo)的PD大鼠模型黑質(zhì)中Bcl-2蛋白水平顯著升高，Bax蛋白水平下降[27]。而柔筋止顫片能抑制ROS通路，減少凋亡蛋白Caspases蛋白的表達(dá)，從而抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[28]。

2.2.2 平肝熄風(fēng)法:前人研究發(fā)現(xiàn)，天麻鉤藤飲能通過上調(diào)Bcl-2蛋白水平，減少Caspase-3激活，抑制魚藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[29]。自擬控顫湯可以減少PD大鼠的旋轉(zhuǎn)數(shù)，改善PD大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，并顯著增加大鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)[30]。在采用6-OHDA制備PD大鼠模型研究中，龜羚帕安丸可以顯著升高模型鼠中腦黑質(zhì)中Bcl-2和Bcl-2/Bax的比值而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[31]。與此類似，斂肝熄風(fēng)養(yǎng)血濡筋方也可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值抑制PD模型細(xì)胞凋亡[32]。此外，銀杏平顫方預(yù)處理可顯著降低MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型凋亡率，且WB法檢測PARP、PTEN的mRNA及蛋白水平均低于模型組[33]。

2.2.3 活血化瘀法:陳煒等[34]在采用魚藤酮制備PD大鼠模型中，使用低中高劑量加味五虎追風(fēng)散干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組比較，大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-syn含量均降低，TH含量均呈劑量依賴性升高，提示加味五虎追風(fēng)散通過抑制α-syn寡聚體形成并增加TH含量，抑制DA能神經(jīng)元凋亡。與此類似，陳松盛等[35]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方能通過抗氧化應(yīng)激、提高TH水平抗細(xì)胞凋亡而對6-OHDA所致PD大鼠起保護(hù)作用。李雙雙[36]用魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞模型并用桃紅四物湯干預(yù)，結(jié)果顯示桃紅四物湯能夠下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞 Bax/Bcl-2、P53、Caspase-3的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)p-ERK/ER，抑制細(xì)胞凋亡。

2.3 針灸治療 近年來，針灸在抑制PD神經(jīng)元細(xì)胞凋亡方面亦取得了一定的成效。吳成舉等[37]探討“雙固一通”電針、頭針兩種不同方法對PD大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的影響，結(jié)果顯示這兩種不同的針灸方法均可以促進(jìn)模型鼠DA的合成，改善大鼠運(yùn)動障礙，并通過提高Bcl-2蛋白及降低Bax蛋白表達(dá)水平，發(fā)揮抗凋亡作用。陳亞麗[38]采用MPTP小鼠腹腔注射法制備PD模型，電針組使用100 Hz連續(xù)波每日或隔日治療，WB檢測結(jié)果提示100 Hz連續(xù)波電針治療能通過抑制磷酸化JNK、P38信號通路的激活，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值，抑制Caspase-3激活而抗細(xì)胞凋亡。李靜等[39]給予魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠電針“百會” “太沖”“三陰交”穴治療后，實(shí)驗(yàn)室檢測發(fā)現(xiàn)大鼠黑質(zhì)中抗氧化酶SOD、GSH-Px含量高于模型組，TH免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)增加，DA能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率下降。與此類似，白妍等[40]也發(fā)現(xiàn)電針“百會”“太陽”穴能通過抑制PD大鼠黑質(zhì)中Caspase-3表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡水平。

3 討論與展望

隨著近年來PD神經(jīng)保護(hù)治療的興起及現(xiàn)代微觀藥理學(xué)研究的進(jìn)展，中醫(yī)藥在抗PD細(xì)胞凋亡的研究已進(jìn)入到分子乃至基因水平。中藥有效成分提取物及針灸治療通過不同分子通路調(diào)控基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、靶點(diǎn)蛋白表達(dá)，在PD早期階段阻止DA能神經(jīng)元變性凋亡。但由于中醫(yī)藥作用機(jī)制復(fù)雜，目前對于抗PD細(xì)胞凋亡具體的作用靶點(diǎn)、介導(dǎo)通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究仍存在著不全面、不系統(tǒng)等短板，中醫(yī)藥抗凋亡作用機(jī)制的研究亟待在未來中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步完善。