川崎病患兒差異表達(dá)基因篩選及相應(yīng)蛋白表達(dá)觀察

崔曉鳴，劉力，張博

1天津市兒童醫(yī)院天津大學(xué)兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300074；2天津市兒童醫(yī)院天津大學(xué)兒童醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；3天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系；4天津市細(xì)胞與分子免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

川崎?。↘awasaki disease，KD）是由日本學(xué)者Tomisaku Kawasaki首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)的一種皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征［1］。KD好發(fā)于5歲以下兒童，主要臨床表現(xiàn)為急性發(fā)熱、皮疹、黏膜血管炎、肝脾淋巴結(jié)腫大等［2］。KD被列為急性兒童血管性疾病，可導(dǎo)致兒童獲得性心臟冠狀動(dòng)脈病變（Coronary artery lesion，CAL），主要包括冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、冠狀動(dòng)脈瘤、冠狀動(dòng)脈狹窄、冠狀動(dòng)脈瘺形成等，癥狀嚴(yán)重者可出現(xiàn)心肌梗死及缺血性心肌病，甚至猝死。KD目前已經(jīng)是發(fā)達(dá)、發(fā)展中國(guó)家兒童最常見的獲得性心臟病的病因［3-4］。目前KD的治療方法為早期大劑量靜脈注射免疫球蛋白（Intravenous Immunoglobulin，IVIG）聯(lián)合阿司匹林［5］。KD的病因目前尚不明確，具有感染、環(huán)境污染及過(guò)敏等多個(gè)假設(shè)［6］。早診斷、早期干預(yù)是KD治療的關(guān)鍵，但目前臨床尚缺少KD診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。我們運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析川崎?。↘D）患兒差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），并觀察KD患兒血清中相應(yīng)DEGs蛋白的表達(dá)變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 KD患兒及健康兒童DEGs篩選

1.1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 KD基因測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)源于Yu Rang Park創(chuàng)建的KD數(shù)據(jù)庫(kù)（Kawasaki Disease Database，KDD）［7］。作為首個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)，KDD包括了亞洲范圍內(nèi)1 283例兒童病例的1 292個(gè)標(biāo)本臨床數(shù)據(jù)和相應(yīng)基因組數(shù)據(jù)。

1.1.2 KD患兒及健康兒童DEGs篩選 通過(guò)R軟件中edgeR軟件包在納入基因組中篩選KD患兒及健康兒童DEGs以對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的差異表達(dá)倍數(shù)（Log2FC）的絕對(duì)值＞1和P＜0.05為條件進(jìn)行篩選［8］。繪制DEGs的火山圖譜，一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，紅色點(diǎn)代表基因表達(dá)上調(diào)，綠色點(diǎn)代表基因表達(dá)下調(diào)，黑色小方塊表示基因沒(méi)有顯著差異變化；橫軸表示差異表達(dá)的倍數(shù)，縱軸表示-Log10（錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）。

1.2 KD患兒及健康兒童外周血中基質(zhì)金屬蛋白酶8（MMP-8）、嗅介蛋白-4蛋白（OLFM4）蛋白水平檢測(cè)

1.2.1 臨床資料 選擇我院2017年7月—2020年7月間收治的典型KD患兒40例。根據(jù)2017年美國(guó)心臟協(xié)會(huì)新版《科學(xué)聲明》，具備以下6項(xiàng)臨床表現(xiàn)中的至少5項(xiàng)：①持續(xù)發(fā)熱≥5 d；②多形性皮疹；③口腔黏膜彌漫充血，楊莓舌，口唇充血皸裂；④急性非化膿性頸部淋巴結(jié)腫大，通常直徑＞1.5 cm；⑤非滲出性雙眼球結(jié)膜充血；⑥肢端變化，急性期掌趾紅斑，手足硬性水腫，恢復(fù)期膜狀脫皮。如果患者僅具備上述主要癥狀中的4項(xiàng)，但超聲心動(dòng)圖或冠狀動(dòng)脈血管造影證實(shí)有CAA或擴(kuò)張時(shí)，也可診斷為典型KD。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，最終入組40例。另選擇15例健康兒童為對(duì)照，排除血液疾病、免疫系統(tǒng)疾病及感染性疾病者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，納入者家屬均知情同意。。

1.2.2 KD患兒及健康兒童外周血MMP-8、OLFM4蛋白水平檢測(cè) 因“1.1”得到的DEGs中MMP-8、OLFM4基因差異最為明顯，最終采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)KD患兒及健康兒童外周血MMP-8、OLFM4，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行（試劑盒選自Abcam公司）。為了減少待測(cè)人群凍存后細(xì)胞數(shù)量和檢測(cè)因子受損嚴(yán)重情況，影響指標(biāo)檢測(cè)，本項(xiàng)目樣本采用新鮮提取的外周血，分批次對(duì)待測(cè)人群進(jìn)行檢驗(yàn)，最終的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一整理。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 mL，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（PBS）50μL，混勻；以此類推，逐步稀釋，最終稀釋后各孔加樣量都為50μL，濃度分別為24、16、8、4和2μg/L；加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測(cè)樣品10μL（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。進(jìn)一步溫育和洗滌。顯色：每孔先加入50μL顯色劑A，再加入50μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測(cè)定。以空白空調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度OD值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel 2013軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SAS 9.4和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)連續(xù)性變量進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的變量以±s表示，采用SAS 9.4中的T test方法用于數(shù)據(jù)比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KD患兒及健康兒童DEGs篩選結(jié)果 與健康兒 童 相 比，KD患 兒 有MMP-8、OLFM4、OLAH、CD177、RETN、CEACAM8、LCN、LTF、ARG1以及HP基因等288個(gè)DEGs，其中表達(dá)上調(diào)186個(gè)、表達(dá)下調(diào)102個(gè)。在此其中，MMP-8和OLFM4差異最為明顯（P均＜0.05）。

2.2 KD患兒及健康兒童外周血MMP-8、OLFM4表達(dá)蛋白水平比較 KD患兒外周血MMP-8、OLFM4表達(dá)水平分別為（73.21±13.66）、（26.37±5.88）ng/mL，健康兒童分別為（46.32±9.38）、（9.37±5.23）ng/mL，二者比較，P均＜0.05。

3 討論

KD，是一種不明原因的急性自限性發(fā)熱性疾病。目前關(guān)于KD的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，包括肺炎支原體、化膿性鏈球菌、皰疹病毒、輪狀病毒在內(nèi)的多種感染均有可能引發(fā)此類疾?。?］。與此同時(shí)，近期發(fā)現(xiàn)遺傳因素在KD形成中也可能發(fā)揮重要作用。一些研究［10］結(jié)果表明，KD存在某些易感性的遺傳因素，其中包括：同卵雙胞胎患KD的風(fēng)險(xiǎn)在13%左右；有KD病史的父母后代KD發(fā)生率增加，以及受影響患者的兄弟姐妹中KD的發(fā)生率增加。全基因組分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因的多態(tài)性與KD發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在家族連鎖和基因組關(guān)聯(lián)研究中，不同基因和基因區(qū)域的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）已被證實(shí)，這其中包括：Caspase-3（CASP3）、肌醇1，4，5-三磷酸激酶c（ITPKC）、CD40、FCGR2a和b以及細(xì)胞淋巴激酶（BLK）［11，12］。許多與KD相關(guān)的SNPs在其他炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、紅斑性狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥中也有發(fā)現(xiàn)。以上研究結(jié)果均證實(shí)炎癥免疫反應(yīng)在這些疾病的發(fā)生發(fā)展中可發(fā)揮重要作用。

盡早發(fā)現(xiàn)和及時(shí)干預(yù)是KD臨床治療的關(guān)鍵。未經(jīng)及時(shí)治療的KD患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈病變的概率在25%左右，也是兒童獲得性心臟病最常見的病因［13，14］。KD與自身免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。迄今為止，盡管對(duì)細(xì)菌毒素、超級(jí)抗原、真菌有機(jī)體和病毒性病原體進(jìn)行了許多研究，但還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何潛在的感染原因。然而，主流學(xué)派仍然堅(jiān)持：未知的刺激引發(fā)了炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活了免疫系統(tǒng)固有的和適應(yīng)性的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致KD的發(fā)生。與此同時(shí)，KD最終形成還需要先天免疫系統(tǒng)通過(guò)檢測(cè)病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）來(lái)激活［15］。

在KD的急性期，循環(huán)促炎性和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量似乎有所增加。研究表明，KD患者的組織和冠狀動(dòng)脈血管壁中產(chǎn)生IgA的漿細(xì)胞數(shù)量有顯著的增加。本研究中也發(fā)現(xiàn)，Macrophages M1和T cells CD8兩類細(xì)胞在KD患者組中存在顯著差異性。Macrophages異常表達(dá)普遍發(fā)生于KD患者。巨噬細(xì)胞活化綜合征（Macrophage activation syndrome，MAS）相關(guān)聯(lián)的KD患者近年來(lái)也逐漸見諸報(bào)道［16，17］。T cells CD8與KD的研究尚未全面展開，值得進(jìn)一步深入研究。IVIG是針對(duì)KD患者目前臨床推薦的主要治療方式。施用IVIG后，患者體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群和B細(xì)胞激活因子的正?；?。所有上述發(fā)現(xiàn)都支持適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在KD中的重要作用。但具體那個(gè)免疫分子發(fā)揮更重要的作用，尚需進(jìn)一步研究。

目前針對(duì)KD缺乏有效的臨床標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-8和OLFM4在KD患者存在顯著性高表達(dá)，并且可以在臨床檢驗(yàn)中得到證實(shí)。MMP是一種鋅依賴性明膠酶。MMP蛋白家族參與自身免疫功能調(diào)節(jié)，可以降低細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［18］。MMP-9（MMP家族中另一個(gè)重要蛋白成員）可以作為兒童嚴(yán)重膿毒癥（一種免疫系統(tǒng)相關(guān)常見疾?。┑臐撛谂R床標(biāo)志物［19，20］。在該研究中，與健康對(duì)照相比，嚴(yán)重膿毒癥患者的血漿MMP-9水平在第1天顯著升高。但是值得注意的是，成人膿毒癥和兒童膿毒癥患者中測(cè)量MMP-9的水平不盡相同。MMP-9在膿毒癥和KD中的作用可能與其在基底膜中裂解膠原蛋白的功能密切相關(guān)有關(guān)。該過(guò)程可以促進(jìn)白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞能夠進(jìn)出外周循環(huán)。OLFM4是一種分泌型糖蛋白，標(biāo)志著中性粒細(xì)胞的一個(gè)子集。

OLFM4異常表達(dá)證實(shí)與兒童膿毒癥惡化相關(guān)［21］?；谝豁?xiàng)單中心、前瞻性隊(duì)列研究，OLFM4可能是兒童膿毒癥預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。OLFM4陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞百分比的增加與病死率相關(guān)。OLFM4陽(yáng)性的升高（≥37.6%）的膿毒癥患者中，56%死亡，而OLFM4陽(yáng)性的＜37.6%的膿毒癥患者病死率為18%。OLFM4陽(yáng)性的與病死率之間的關(guān)聯(lián)經(jīng)得起年齡、性別、絕對(duì)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、合并癥和疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量（SOFA評(píng)分，APACHEⅢ）的調(diào)整。OLFM4陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞百分比與膿毒癥的60天病死率獨(dú)立相關(guān)，并且可能代表了宿主對(duì)膿毒癥反應(yīng)異質(zhì)性的新衡量標(biāo)準(zhǔn)。一項(xiàng)以小鼠為動(dòng)物模型的研究［22］發(fā)現(xiàn)，OLFM4基因缺失的小鼠可以顯著的擺脫膿毒癥影響。當(dāng)在小鼠中誘導(dǎo)膿毒癥時(shí)，OLFM4-null小鼠的存活率顯著增加。膿毒癥誘導(dǎo)后24 h的免疫組織化學(xué)表明腎臟中OLFM4的表達(dá)增加，其定位于Loop of Henle。與OLFM4-null小鼠相比，野生型小鼠的腎細(xì)胞凋亡和血漿肌酐顯著增加。最后，骨髓移植表明腎臟中增加的OLFM4反映了局部產(chǎn)生而不是從血漿中過(guò)濾出來(lái)。以上研究證實(shí)MMP-8和OLFM4與兒童免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

本項(xiàng)目從多角度全面比較了KD患者的差異性基因和特異性免疫細(xì)胞表達(dá)，并提出2個(gè)潛在的臨床標(biāo)志物。然而，本研究為單中心研究，樣本量有限，尚存在一定的局限性。為了使這些標(biāo)志物更有效的進(jìn)行臨床推廣，未來(lái)還需要進(jìn)行多中心、大樣本量研究。

綜上所述，KD患兒主要有MMP-8、OLFM4等288個(gè)DEGs。KD患兒外周血中MMP-8、OLFM4蛋白表達(dá)水平升高，存在顯著性差異。MMP-8、OLFM4可能作為KD檢測(cè)的潛在臨床標(biāo)志物。