赤擬谷盜角蛋白KAP19-2基因參與磷化氫抗性發(fā)生機理

車美玲 孟宏杰 唐培安 王康旭

摘要：為探明角蛋白相關基因——KAP19-2在害蟲磷化氫（PH3）抗性產生中的作用，以赤擬谷盜為研究對象，利用熒光定量PCR技術檢測解析角蛋白相關基因KAP19-2在赤擬谷盜不同發(fā)育時期、不同抗性種群及PH3脅迫后的表達模式。定量結果表明：KAP19-2主要在剛羽化3 h后的成蟲體內大量表達，是蛹期平均表達水平的22.79倍，與其他發(fā)育時期表達量均存在顯著性差異；同時，該基因在抗性種群的表達量高于敏感種群，并具有顯著性差異，其相對表達量與赤擬谷盜不同抗性種群的抗性倍數(shù)呈正相關。在PH3脅迫處理條件下，KAP19-2基因在敏感種群處理6 h后的相對表達量最低，在抗性種群處理20 h后的相對表達量最低。因此認為該基因參與PH3抗性形成。

關鍵詞：赤擬谷盜；角蛋白；磷化氫抗性；KAP19-2

中圖分類號：S379.5 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20210225

赤擬谷盜（Tribolium castaneum）是一種危害性強的世界性儲糧害蟲，通過直接取食、糞便污染及加速霉變等方式對儲糧進行危害。在儲藏物害蟲防治方面，磷化氫（PH3）具有高毒力、低殘留、無植物毒性、使用方便等特點，是防治儲藏物害蟲性能最優(yōu)良的熏蒸劑之一。赤擬谷盜在國內倉庫通常使用PH3熏蒸處理進行防治，由于長期單一使用，導致赤擬谷盜PH3抗性日益嚴重，對國儲糧安全構成重大威脅[1-4]。轉錄組學研究表明，赤擬谷盜不同PH3抗性種群基因表達量存在明顯差異，其中包括角蛋白相關基因KAP19-2，該基因在赤擬谷盜PH3抗性種群為上調基因[4]，但其在PH3抗性行成中的功能尚不清楚。

角蛋白是纖維結構蛋白家族之一，它是構成頭發(fā)、角、爪和人體皮膚外層的主要蛋白質。角蛋白可保護上皮組織細胞免受損傷或壓力。角蛋白單體組成束以形成中間纖維蛋白[5]。早期研究認為中等纖維（Intermediate Filament，IF）僅存于脊椎動物細胞中[6]，陳新華等[7]通過免疫印跡等實驗表明斜紋夜蛾和甜菜夜蛾細胞中的IF主要由角蛋白組成。角蛋白KAPs被認為是與毛質性狀相關的蛋白家族，研究的對象集中于家兔、綿羊和人等，研究的內容多見于遺傳多樣性方面[8]。本實驗采用熒光定量PCR技術探究赤擬谷盜KAP19-2基因的發(fā)育表達模式，預測特定基因在赤擬谷盜不同發(fā)育時期的作用及功能；分析該基因在PH3脅迫前后的表達模式，從分子生物學的角度驗證相關基因在PH3抗性形成的作用，為揭示赤擬谷盜PH3抗性形成機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試蟲源

本實驗選用采自5個不同地區(qū)的赤擬谷盜種群，分別為蘇州胥口（XK）、云南西雙版納（YN）、常德金?。↗J）、成都（CD）、深圳（SZ），并已在南京財經大學食品科學與工程學院儲糧害蟲實驗室連續(xù)培養(yǎng)，試蟲飼養(yǎng)和設備使用參照文獻[3]描述的操作方式進行，試蟲詳細信息見表1。

1.1.2 主要試劑和儀器

HiScript？ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQTM SYBR？ Qpcr Master Mix：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Loading Buffer（Takara），50×TAE（Solarbio），Trizol？ Reagent（分析純，Invitrogen），瓊脂糖（HyAgarose），三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇（分析純），濃硫酸（優(yōu)級純），

Zn3P2。

7500型熒光定量PCR儀：賽默飛世爾科技有限公司；BSC-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Hamilton 7000型氣密性注射器：北京英偉達科技有限公司；HL-200- PH3型PH3氣體報警儀：北京佳糧科貿有限公司。

1.2 試蟲處理

不同發(fā)育時期樣本收集（供試蟲源：XK）：將帶有卵的飼料在適宜飼養(yǎng)條件下培養(yǎng)至孵化，收集足量（數(shù)百頭）1齡幼蟲，部分置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?，其余幼蟲置于添加飼料的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，待其蛻皮后，收集足量的2齡幼蟲，按照上述方法保存及培養(yǎng)，依次收集足量的3、4、5齡幼蟲，預蛹，5日齡蛹，羽化后3 h、7 d成蟲（羽化7 d后，試蟲發(fā)育趨于成熟[9] ）。每個樣本均設3個生物學重復。

不同抗性種群樣本收集（供試蟲源：XK、YN、JJ、CD、SZ）：挑選羽化后7 d左右的赤擬谷盜成蟲進行實驗（無性別區(qū)分）。PH3氣體制備：由Zn3P2粉末和10%的硫酸反應生成PH3氣體，采用聯(lián)合國糧農組織（FAO）推薦的PH3發(fā)生裝置收集氣體，氣體發(fā)生裝置見圖1。使用PH3氣體檢測儀測定氣體濃度。

PH3脅迫：對YN和SZ種群的試蟲進行PH3脅迫處理。在生物測定的基礎上，選擇試蟲的LC30作為PH3脅迫濃度，并設置不同的時間梯度，采用熏蒸法進行脅迫處理，具體方法：將每個種群至少50頭羽化后7～10 d的成蟲放入熏蒸瓶中，并密封，根據(jù)試蟲的亞致死濃度，用氣密性注射器抽取一定量的PH3氣體（YN：17 μL；SZ：5 mL），分別注入各熏蒸瓶中，用蠟封注射口，然后將其置于溫度（30±1）℃、濕度（75±5）%、無光照的培養(yǎng)箱中密閉熏蒸。分別處理1、2、6、12、20 h。PH3脅迫結束后，迅速挑選生理狀態(tài)良好的赤擬谷盜，分別置于凍存管中，做好標記，并置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。以未處理? h）的試蟲作為空白對照，每個處理設置3個生物學重復。

1.3 試蟲總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

采用Trizol 法[10]提取上述收集和處理的試蟲的總RNA，用酶標儀測定RNA濃度和純度，并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶是否清晰完整，以便進行后續(xù)實驗。然后按照HiScript？Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒說明書進行操作，合成cDNA，并放于-20 ℃冰箱保存。

1.4 內參基因的選擇及定量PCR引物設計

參照文獻[11]使用RPS6作為試蟲不同發(fā)育時期定量實驗的內參基因；選擇雙內參組合：RPS18和RPL13作為不同抗性種群試蟲定量實驗的內參基因。使用NCBI中的Primer-Blast設計用于熒光定量PCR的所有引物。定量引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。相關引物、內參基因序列見表2。

1.5 熒光定量PCR

熒光定量PCR反應采用ChamQTM SYBR？ qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）試劑盒，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，USA）進行qPCR，對角蛋白相關基因KAP19-2的相對表達量進行分析，實驗中的每個種群設置3個生物學重復。每個熒光定量PCR反應對3個重復樣品（生物重復）進行3次（技術重復），按照試劑盒說明書配制溶液，操作方法參考文獻[3]。

1.6 基因引物篩選及驗證

使用1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴增產物長度和電泳條帶數(shù)目判斷引物是否有非特異性，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，USA）進行qPCR，根據(jù)熔解曲線的單一性判斷引物的特異性。取樣品的cDNA模板，將其依次稀釋5個濃度梯度，測定并計算PCR擴增效率（E）和相關系數(shù)（R2）。擴增效率按式（1）計算。綜合參考引物特異性驗證的結果與引物擴增效率，最終篩選出用于熒光定量PCR的最佳引物。

E = （10-1/K-1） × 100% （1）

式中：E為擴增效率，%；K為標準曲線斜率。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結果用平均數(shù)±SD表示，運用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（One-Way ANOV）中的Turkey式多重比較法，對赤擬谷盜3條表皮相關基因在不同發(fā)育時期和不同組織的相對表達量進行差異顯著性分析（P = 0.05，置信區(qū)間為95%）。

2 結果與分析

2.1 RNA質量分析

圖2為提取的赤擬谷盜不同發(fā)育時期、不同種群赤擬谷盜的總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。由圖2可知，RNA條帶清晰明亮，無彌散現(xiàn)象，酶標儀檢測得OD260/OD280均在1.8～2.2的范圍內，說明RNA完整性良好、未降解，可作為合成cDNA模板。

2.2 引物特異性驗證和擴增效率分析

采用普通PCR擴增角蛋白KAP19-2基因和3個內參基因，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段，擴增片段符合預期，條帶單一且清晰明亮，表明無引物二聚體等現(xiàn)象，所設計的引物具有特異性。使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)對引物進行標準曲線和溶解曲線分析（圖3），可以發(fā)現(xiàn)，每條引物的熔解曲線都是單一峰，且4對引物的相關系數(shù)在0.997～0.998，擴增效率在99.92%～102.70%（表3），符合PCR對特異性引物的試驗要求，可用于后續(xù)定量試驗。

2.3 赤擬谷盜KAP19-2基因在不同發(fā)育時期表達模式分析

赤擬谷盜角蛋白KAP19-2基因在試蟲不同發(fā)育時期的相對表量如圖4所示。角蛋白相關基因KAP19-2主要在剛羽化成蟲期大量表達，是蛹期平均表達水平的22.79倍，與其他發(fā)育時期表達量均存在顯著性差異（P<0.05）；其他發(fā)育時期表達量較少。

2.4 赤擬谷盜KAP19-2基因在不同PH3抗性種群的表達模式分析

赤擬谷盜角蛋白KAP19-2基因在不同PH3抗性種群的相對表達水平如圖5所示。由圖5可知，KAP19-2基因在抗性種群的表達量高于敏感種群且具有顯著性差異（P<0.05），且該基因的相對表達量與抗性倍數(shù)呈正相關。

2.5 赤擬谷盜KAP19-2基因在PH3脅迫下的表達模式分析

敏感（YN）和抗性（SZ）種群赤擬谷盜KAP19-2基因在PH3脅迫前后的相對表達水平如圖6所示。由圖6可知：敏感種群KAP19-2基因處理1 h和6 h后，與未處理組（0 h）相比其相對表達量顯著下降（P<0.05）。抗性種群KAP19-2基因經PH3處理不同時間后，其相對表達量呈先上升再下降的趨勢，在處理20 h時出現(xiàn)最低值，相比未處理組（0 h）差異顯著（P<0.05）；該基因在脅迫前后的相對表達量無顯著性差異（P>0.05）。PH3脅迫對該基因在敏感和抗性種群中的表達模式具有不同的影響。

3 討 論

赤擬谷盜角蛋白相關基因KAP19-2主要在羽化3 h的成蟲期大量表達，在其他發(fā)育時期表達量較低，幼齡成蟲到羽化3 h的成蟲階段KAP19-2表達量上升了近44倍。轉錄組學研究表明該基因在赤擬谷盜磷化氫抗性種群中為上調基因，并有研究[12]猜測該基因在節(jié)肢動物中促進入侵微生物在損傷部位的固定。趙濛等[8]研究發(fā)現(xiàn)阿爾巴斯白絨山羊KAP3.1基因在毛囊興盛期較低表達，在退行期前表達量達到頂峰，退行期后表達水平逐漸降低，說明此類基因在生長過程中表達量均會發(fā)生明顯變化，猜測KAP19-2在赤擬谷盜生長過程中發(fā)揮了作用。

赤擬谷盜角蛋白相關基因KAP19-2在磷化氫抗性種群中表達量呈上調趨勢，在抗性種群的相對表達量顯著高于敏感種群。由此推測，KAP19-2可能參與了赤擬谷盜磷化氫抗藥性的形成。角蛋白具有很強的抗牽張性能，在動物體內起保護作用[13]。金梅等[14]發(fā)現(xiàn)可以通過外源干擾，在毛囊發(fā)育的不同時期利用K26及KAP26.1基因過表達對其他基因的影響調控絨毛細度，影響發(fā)育周期。KAP19-2和KAP26.1屬于同一個家族的角蛋白關聯(lián)蛋白，其功能可能相似，均影響了動物的正常發(fā)育。為了進一步驗證KAP19-2基因是否介導赤擬谷盜磷化氫抗藥性的形成，利用熒光定量PCR技術對磷化氫敏感和抗性種群赤擬谷盜KAP19-2基因在磷化氫脅迫前后的表達量進行分析，結果表明：受磷化氫脅迫后KAP19-2在敏感種群中的表達量呈波動變化，無明顯規(guī)律；在抗性種群中總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在2 h相對表達量達到峰值，提示磷化氫脅迫可能對抗性種群具有一定誘導作用，但是長時期誘導后表達量迅速下降，可能會使抗性種群對磷化氫敏感，降低抵御磷化氫毒性的能力，這有待進一步的研究。

參 考 文 獻

[1]張來林，陸亨久，尚科旗.磷化氫熏蒸殺蟲存在的問題及改進措施[J].糧食科技與經濟，2005（5）：38-39.

[2]曹陽.我國谷蠹、赤擬谷盜、銹赤扁谷盜和土耳其扁谷盜磷化氫抗藥性調查[J].河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2006（1）：1-6.

[3]王亞洲，劉蔓文，唐培安，等.湖南省12個赤擬谷盜品系對磷化氫和敵敵畏抗性測定[J].糧食科技與經濟，2018，43（9）：42-45.

[4] OPPERT B， GUEDES R N C， AIKINSI M J， et al. Genes related to mitochondrial functions are differentially expressed in phos- pine-resistant and -susceptible Tribolium castaneum [J]. BMC Genomics， 2015， 16（1）： 968.

[5]李志強.生皮化學與組織學[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2010：94-116.

[6]蔡樹濤，翟中和，李炎靖.寇氏隱甲藻（ Crypthecodinium cohnii ）細胞核骨架與中間纖維的研究[J].實驗生物學報，1991，24（3）： 33-34.

[7]陳新華，余澤華，陳曲候.昆蟲細胞中存在角蛋白纖維[J].中國組織化學與細胞化學雜志，1996（2）：214-218.

[8]趙濛，李婕，奈日樂，等.角蛋白關聯(lián)蛋白基因3.1在絨山羊不同時期皮膚中的表達[J].中國畜牧雜志，2016（52）：13.

[9] JASRAPURIA S， SPECHT C A， KRAMER K J， et al. Gene Families of Cuticular Proteins Analogous to Peritrophins（CPAPs） in Tribolium castaneum Have Diverse Functions[J]. PLoS ONE， 2012， 7（11）： e49844.

[10]董小林.昆蟲總RNA提取及實時熒光定量PCR方法探討[J].應用昆蟲學報，2013，50（5）：1469-1473.

[11] TOUTGES M J， HARTZER K， LORD J， et al. Evaluation of Reference Genes for Quantitative Polymerase Chain Reaction across Life Cycle Stages and Tissue Types of Tribolium castaneum [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010， 58（16）： 8948-8951.

[12] MATSUDA Y， OSAKI T， HASHII T， et al. A cysteine-rich protein from an arthropod stabilizes clotting mesh and immobilizes bacteria at injury sites[J]. J Biol Chem，2007，282：33545-33552.

[13]賈如琰，何玉鳳，王榮民，等.角蛋白的分子構成、提取及應用[J].化學通報（印刷版），2008（4）：27-33.

[14]金梅，康琳，孫東禹，等.慢病毒介導小鼠K26/KAP26.1基因過表達對相關基因的調控作用[J].中國農業(yè)科學，2017，50（10）：1896-1906.

Keratin Related Gene KAP19-2 of Tribolium Castaneum Participates in the Mechanism of Phosphine Resistance

Che Meiling， Meng Hongjie， Tang Peian， Wang Kangxu

（ School of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics/Jiangsu Modern Grain Circulation and Security Coordination Innovation Center， Nanjing， Jiangsu 210023 ）

Abstract： To study the role of keratin-associated protein 19-2 （KAP19-2） in phosphine resistance of pests， this paper took T. castaneum as the research object， analyzed the expression pattern of keratin-related gene KAP19-2 in different development stages， different resistant populations and PH3 stress by Fluorescent quantitation PCR technology. The quantitative results showed that KAP19-2 was mainly expressed in adults just 3 hours after emergence， which was 22.79 times of the average expression level in pupal stage， and there were significant differences between KAP 19-2 and other developmental stages. At the same time， the expression level of the gene in the resistant population is higher than that in the sensitive population， and there is a significant difference， and its relative expression level is positively correlated with the resistance multiple of different resistant populations of T. castaneum. Under the condition of PH3 stress， the relative expression of KAP19-2 gene was the lowest in sensitive population after 6h treatment and the lowest in resistant population after 20 h treatment. Therefore， it is considered that this gene is involved in the formation of PH3 resistance， but its specific mechanism needs further study.

Key words： T. castaneum， keratin， phosphine resistance， KAP19-2