液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腐乳中的生物胺

陳召桂，鄭國建，朱玲琳

（1.浙江五芳齋實(shí)業(yè)股份有限公司，浙江嘉興 314031；2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233）

腐乳是我國具有民族特色的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，被稱為“中國干酪”[1]，年產(chǎn)量達(dá)3萬t[2]。腐乳在中國擁有1 800余年的歷史[3]，受到國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。我國傳統(tǒng)腐乳較多采用開放式發(fā)酵工藝，加工工藝粗放，手工操作環(huán)節(jié)較多，同時(shí)腐乳經(jīng)微生物發(fā)酵后含有豐富的氨基酸，為生物胺的形成提供了較好的條件[4-6]。盡管生物胺在機(jī)體內(nèi)具有重要的生理功能，但當(dāng)人體攝入過量時(shí)會(huì)引起中毒反應(yīng)（如頭痛、頭暈、高血壓、心悸等），嚴(yán)重的甚至危及生命[7-8]。

用于食品中生物胺測(cè)定的方法包括薄層色譜法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]、氣相色譜法[11]、離子色譜法[12-13]、柱前衍生液相色譜法[14-15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[16-17]等?，F(xiàn)行有效的國標(biāo)方法為GB 5009.208—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測(cè)定》[18]，該標(biāo)準(zhǔn)中試樣用5%三氯乙酸提取，正已烷去除脂肪，三氯甲烷-正丁醇（1∶1，V/V）液液萃取凈化后，用丹磺酰氯進(jìn)行柱前衍生，并用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器進(jìn)行定量分析。在實(shí)際檢測(cè)過程中，腐乳中存在較多的游離氨基酸，會(huì)和丹磺酰氯進(jìn)行反應(yīng)，容易對(duì)生物胺的檢測(cè)造成較大干擾[19]。本實(shí)驗(yàn)將建立一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)腐乳中生物胺的方法，為生產(chǎn)中快速測(cè)定腐乳中的生物胺含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

組胺（histamine，HIST）、酪胺（tyramine，TYR）、尸胺（cadaverine，CAD）、腐胺（putrescine，PUT）、色胺（tryptamine，TRP）、精胺（spermine，SPM）、亞精胺（spermidine，SPD）、苯乙胺（phenylethylamine，PEA）、章魚胺（octopamine，OCT）（純度均≥99%）：美國Sigma公司；甲酸、三氟乙酸、乙腈（色譜純）：德國Merck公司；濃鹽酸、三氯乙酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水由Millipore Milli-Q超純水儀生產(chǎn)；腐乳樣品（白1、白2、白2、紅1、紅2、紅3、臭1、臭2、臭3、臭4）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

XEVO TQXS 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI））：美國Waters公司；5804離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Votex3000渦旋振蕩儀：德國Wiggens公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱。流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫：0～1 min，95%A保持不變；1～6 min，95%A線性變化至0%A；6～8 min，0%A保持不變；8.1 min變化至95%A，平衡2 min。柱溫：35 ℃。流速：0.3 mL/min。進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子（electrosprayionization，ESI）源，正電離模式；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；干燥氣溫度：400 ℃；干燥氣流速：800 L/h；錐孔反吹氣流速：150 L/h；離子源溫度：150 ℃；離子對(duì)、碰撞能量見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameters of mass spectrometer

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取9種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取1.0 mL生物胺單組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用初始流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、150ng/mL、200 ng/mL系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 樣品處理

取出腐乳約10 g于均質(zhì)機(jī)中混勻，取1 g混勻后的樣品，加入30 mL 5%三氯乙酸水溶液，渦旋混勻15 s后超聲提取30 min。取出后用5%三氯乙酸水溶液定容至50 mL。8 000 r/min離心2 min，上清液經(jīng)0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜后供LC-MS/MS儀器測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐乳前處理方法的優(yōu)化

生物胺具有較強(qiáng)的極性，前處理時(shí)還需要沉淀樣品中的蛋白質(zhì)和肽段等雜質(zhì)，所以試驗(yàn)中考察了三種提取試劑的提取效果，分別是乙腈-水溶液（8∶2，V/V）、0.1%甲酸乙腈-水（8∶2，V/V）和5%三氯乙酸水溶液。使用上述三種提取溶劑處理同一腐乳樣品，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析后，比較三種處理方法得到的各生物胺的相對(duì)峰面積如圖1所示。

圖1 不同提取試劑的提取效果Fig.1 Extraction effect of different extraction solvents

由圖1可知，3種提取溶劑具有相近的提取效果，相對(duì)偏差＜10%。而5%三氯乙酸水溶液相對(duì)于其他兩種提取溶劑的提取效率略高，故選取5%三氯乙酸水溶液進(jìn)行樣品前處理。

2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在優(yōu)化液相色譜條件時(shí)，考察了乙腈-水體系、乙腈-0.1%甲酸水體系、以及乙腈-0.1%三氟乙酸水體系，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，由于部分生物胺極性較大，所以在乙腈-水體系、乙腈-0.1%甲酸水體系的色譜條件下基本沒有保留，不易和樣品中的雜質(zhì)分離。而使用乙腈-0.1%三氟乙酸水體系時(shí)這部分生物胺保留得到改善，因此最終選擇乙腈-0.1%三氟乙酸水體系進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中復(fù)雜的干擾物對(duì)分析物質(zhì)譜響應(yīng)的抑制或增強(qiáng)，可用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線斜率的比值進(jìn)行評(píng)估[21]。結(jié)果表明，組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、精胺、亞精胺、苯乙胺、章魚胺在腐乳基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)比值分別為0.92、0.91、0.85、0.88、0.82、0.89、0.87、0.94、0.84，在0.82～0.94之間，表明9種生物胺的響應(yīng)被樣品中的干擾物質(zhì)輕微抑制。

2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

使用初始流動(dòng)相將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量為橫坐標(biāo)，各生物胺峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2），各分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，線性相關(guān)性較好。

表2 9種生物胺的線性范圍和線性關(guān)系Table 2 Linear range and relationship of 9 biogenic amines

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用5%三氯乙酸水溶液稀釋后測(cè)定，以3倍信噪比作為方法的檢出限，以10倍信噪比作為方法的定量限，獲得目標(biāo)物的檢出限和定量限。本方法針對(duì)9種生物胺的檢出限為0.03 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg。

2.5 回收率和精密度

由于腐乳中含有較高含量的生物胺，所以為了消除本底對(duì)加標(biāo)回收的影響，本實(shí)驗(yàn)選取了一款本底生物胺含量較低的紅腐乳進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，添加量為10 mg/kg和20 mg/kg，平行測(cè)定6次，結(jié)果見表3。

由表3可知，加標(biāo)回收率在85%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative sandard deviation，RSD）在0.9%～4.8%之間，因此該方法用來檢測(cè)腐乳中生物胺的含量是可靠的。

表3 腐乳中生物胺的回收率及方法精密度試驗(yàn)Table 3 Recovery and method precision tests of biogenic amine in sufu

2.6 實(shí)際樣品中生物胺的檢測(cè)

采用本方法對(duì)市售的10批次不同企業(yè)生產(chǎn)的腐乳中生物胺含量進(jìn)行測(cè)定（表4）。結(jié)果表明腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、色胺、2-苯乙胺、組胺、酪胺以及章魚胺在腐乳中的含量范圍分別是：1.47～169 mg/kg、＜50.7 mg/kg、未檢出、未檢出、＜116 mg/kg、0.22～128 mg/kg、＜120 mg/kg、1.41～191 mg/kg、未檢出。同一品種的腐乳中生物胺含量存在顯著差異，可知其加工工藝存在很大區(qū)別，或生產(chǎn)的環(huán)境良莠不齊。為保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性，有必要對(duì)其加工過程制定相應(yīng)的良好操作規(guī)范。

表4 實(shí)際樣品中生物胺含量的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of biogenic amines in samples

3 結(jié)論

本研究建立了一種使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腐乳中9種生物胺的方法。該方法中9種生物胺在質(zhì)量濃度為10～200 ng/mL范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.999；檢出限為0.03 mg/kg；定量限為0.1 mg/kg；該方法具非常好的準(zhǔn)確度和精密度，回收率在85%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～4.8%，適用于腐乳中生物胺的測(cè)定。使用該方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，生物胺含量在不同品種、不同生產(chǎn)企業(yè)間的腐乳中差異較大，說明我國傳統(tǒng)腐乳的加工環(huán)境、加工工藝沒有統(tǒng)一的良好操作規(guī)范，急需腐乳行業(yè)引起重視。