實驗室芽孢桿菌菌種庫中高產(chǎn)蛋白酶、糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的測定與篩選

王夢超，鄭宏臣，趙興亞，徐健勇，肖冬光，宋 詼

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308）

芽孢桿菌是一龐大種群，在自然界中分布范圍廣并且有著較強的繁殖能力以及穩(wěn)定的理化性質(zhì)[1]，在科研和生產(chǎn)中應(yīng)用較廣，具有較高的研究價值。芽孢桿菌產(chǎn)酶種類多，抗逆性強，多數(shù)菌株可以分泌胞外酶，并且多為安全性高以及人畜無害的非致病菌[2-3]，所以在食品等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。截至目前，全球大約有50%的工業(yè)酶制劑是由芽孢桿菌產(chǎn)生的[6]，芽孢桿菌是蛋白酶的主要生產(chǎn)菌株[7]，蛋白酶作為用途最為廣泛的工業(yè)酶制劑之一[8-10]，在食品、醫(yī)藥、環(huán)保、釀造和皮革等工業(yè)均有廣泛應(yīng)用[11-14]；除此之外，近年來發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌中還存在著豐富的糖基轉(zhuǎn)移酶資源，糖基轉(zhuǎn)移酶是現(xiàn)階段具有廣泛應(yīng)用潛力的新型酶[15-17]，目前利用糖基轉(zhuǎn)移酶合成糖苷類化合物已經(jīng)取得了一定的研究進展，并且在利用糖基轉(zhuǎn)移酶合成新型甜味劑方面也具備良好的應(yīng)用前景，是新酶研究的熱點之一[18]。

綜上，雖然芽孢桿菌具備菌種多樣性和產(chǎn)酶能力高等突出優(yōu)點，但截至目前其豐富的菌種資源還有待深入開發(fā)和研究。本研究對實驗室芽孢桿菌菌種庫中各菌株產(chǎn)蛋白酶、糖基轉(zhuǎn)移酶及胞外蛋白分泌等特性進行了綜合檢測和評價分析，并從中篩選得到具有開發(fā)潛力的蛋白酶和糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株，對于開發(fā)有價值的芽孢桿菌菌種資源及其進一步的應(yīng)用研究奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 芽孢桿菌菌種

400株芽孢桿菌菌株（按1～400進行編號并保存于本實驗室）：前期從天津大港土壤樣品中分離篩選獲得，形成實驗室小型芽孢桿菌菌種資源庫，供各種用途的芽孢桿菌菌種篩選備用。

1.1.2 試劑

氯化鈉（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；蛋白胨、酵母粉、酪蛋白（均為生化試劑）：上海漢尼生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphoglucose，UDPG）、甜菊糖、萊鮑迪苷A（均為分析純）：上海畢得醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L；制備固體培養(yǎng)基時添加20 g/L的瓊脂粉，pH7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQWY-200S全溫培養(yǎng)搖床：天津億諾科學(xué)儀器有限公司；Epoch 2TC酶標(biāo)儀：美國Biotek公司；Microfuge 16離心機：德國Sigma公司；CascadaIII.I純水儀：美國頗爾公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TW2水浴鍋：德國Abo公司；Waters e2695高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 主要溶劑的配制

0.4mol/L三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）：稱取6.54 g三氯乙酸溶解于蒸餾水中，定容至100 mL。

0.2g/L酪蛋白溶液：稱取2.0 g酪蛋白，加入2～3滴氫氧化鈉溶液潤濕酪蛋白，加入少量對應(yīng)pH的磷酸鹽緩沖液（中性pH為7.5，堿性pH為9.0），沸水浴5 min后加入相應(yīng)磷酸鹽緩沖液80 mL左右，攪拌至酪蛋白完全溶解。冷卻到室溫后調(diào)節(jié)至需要的pH，再用相應(yīng)磷酸鹽緩沖液定容至100 mL。放入4 ℃冰箱保存，保質(zhì)期約為7 d。

甜菊糖（100 mmol/L）：80 mg甜菊糖溶于1 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.5）中，于-20 ℃保存，備用。

UDPG（60 mmol/L）：36 mg UDPG溶于1 mL無菌水中，保存于-20 ℃?zhèn)溆?，保質(zhì)期60 d。

1.3.2 菌株培養(yǎng)及胞外發(fā)酵液制備

將菌種庫中的菌株由甘油管經(jīng)劃線活化，共活化成功335株菌株，接單克隆于小試管中（LB培養(yǎng)基）培養(yǎng)9 h后，再接三角瓶進行擴大培養(yǎng)24 h，裝液量為20mL/100 mLLB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后12 000 r/min離心4 min取上清為粗酶液，于-20 ℃保存?zhèn)溆茫４鏁r間2～3 d。

1.3.3 蛋白酶的檢測及篩選

以酪蛋白為底物測定各菌株胞外發(fā)酵液的蛋白酶酶活力，規(guī)定在特定條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個活力單位（IU）。本研究對蛋白酶的檢測及篩選以實驗室保存的模式菌株B.subtilis168、B.subtilisWB600、B.subtilisWB800，以及蛋白酶生產(chǎn)菌株1016和B.amyloliquefaciensBAP為對照菌株，參照生產(chǎn)菌株在本篩選體系的產(chǎn)酶水平，確定野生芽孢桿菌胞外產(chǎn)酶大于100 U/mL為相對高產(chǎn)菌株。

測定條件為中性蛋白酶活性在40 ℃、pH 7.5的條件下測定，堿性蛋白酶活性在50 ℃、pH 9.0條件下測定[19]，具體操作如下：

先將酪蛋白溶液放入測定溫度的水浴鍋中，預(yù)熱5 min；每株菌酶活的測定都做3個平行實驗，準(zhǔn)備4個2 mL EP管，1個標(biāo)為對照組，剩下3個為實驗組，將4個EP管均加入250 μL粗酶液，置于測定溫度的水浴鍋中（中性蛋白酶40 ℃，堿性蛋白酶50 ℃）預(yù)熱2 min。

對照組加入500 μL、0.4 mol/L三氯乙酸（TCA），實驗組加入250 μL2%酪蛋白溶液輕輕混勻，同時置于待測溫度（中性蛋白酶40 ℃，堿性蛋白酶50 ℃）水浴鍋中水浴10 min，待反應(yīng)即將結(jié)束時輕晃混勻。

反應(yīng)結(jié)束后對照組加入250 μL 2%酪蛋白溶液，實驗組加入500 μL 0.4 mol/L三氯乙酸（TCA），混勻后12 000 r/min離心15 min，取200 μL上清于酶標(biāo)板測OD280nm值。

樣品的酶活力按下式計算：

式中：Y為樣品與對照之間的吸光度差值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中的酪氨酸含量，μg；4為將250 μL上清酶液換算成1 mL酶液；n為酶液稀釋倍數(shù)；反應(yīng)時間為10 min。

1.3.4 糖基轉(zhuǎn)移酶的檢測及篩選[20]

利用本實驗室構(gòu)建的成熟轉(zhuǎn)化體系進行糖基轉(zhuǎn)移酶的篩選，以甜菊糖和萊鮑迪苷A各50%的混合物為底物，每個株菌的測定都設(shè)一個對照組提前終止反應(yīng)。

反應(yīng)體系：粗酶液175 μL、終濃度為60 mmol/L 的UDPG 15 μL、終濃度為100 mmol/L的甜菊糖和萊鮑迪苷A各50%的混合物10 μL，最后于220 r/min、37 ℃反應(yīng)24 h。

終止反應(yīng)體系：體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇溶液160μL、1mol/L的硫酸溶液16 μL。

反應(yīng)終止后12 000 r/min離心10 min取上清過膜過濾除菌進行液相定性分析。

色譜條件為Innoval ODS-2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相乙腈∶水=68∶32，V/V；柱溫40℃；流速0.5mL/min；進樣量10 μL；檢測時間10 min；檢測波長210 nm。

樣品的底物轉(zhuǎn)化率按計算公式如下：

式中：A0為St或Reb A的底物初始濃度，mmol/L；At為St或Reb A反應(yīng)后剩余濃度，mmol/L。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

發(fā)酵液上清經(jīng)TCA沉淀后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌菌種庫中菌株產(chǎn)蛋白酶的總體情況分析

本研究對菌種庫中活化成功的335株菌株進行了產(chǎn)蛋白酶情況的聚類分析，并以實驗室保存的模式菌株B.subtilis168、B.subtilisWB600、B.subtilisWB800，以及蛋白酶生產(chǎn)菌株1016和B.amyloliquefaciensBAP為對照菌株，對335株菌株進行產(chǎn)蛋白酶的測定與分析，結(jié)果見圖1。

圖1 芽孢桿菌菌種庫中菌株產(chǎn)蛋白酶的總體情況分析Fig.1 Analysis of protease-producing characteristics of strains in Bacillus strains library

由圖1可知，芽孢桿菌菌種庫中可產(chǎn)胞外蛋白酶的菌株共計267株，占79.7%，蛋白酶缺陷菌株68株，占比20.3%，由此可知整個芽孢桿菌菌種庫大部分菌株具有產(chǎn)胞外蛋白酶的能力，對于菌種庫中的蛋白酶缺陷菌株同樣具有良好的研究開發(fā)前景，應(yīng)用該類菌株作為表達外源蛋白的宿主菌，可在不影響胞外蛋白分泌表達的情況下避免外源蛋白的降解，從而形成更具潛力的新型外源蛋白表達系統(tǒng)。除此之外，在可產(chǎn)蛋白酶的267株中只產(chǎn)中性蛋白酶菌株50株，占比18.7%，只產(chǎn)堿性蛋白酶菌株82株，占比30.7%，同時產(chǎn)中性和堿性蛋白酶的菌株有135株占比50.6%，可見，產(chǎn)單一蛋白酶的菌株所占比例相對較小，半數(shù)以上的菌株可產(chǎn)多種蛋白酶。因此，在本芽孢桿菌菌種庫中篩選不同蛋白酶的高產(chǎn)菌株將具有良好的研究開發(fā)前景。

2.2 中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選

對185株可產(chǎn)中性蛋白酶的芽孢桿菌菌株，對比發(fā)酵24 h后的胞外酶活，得到12株中性蛋白酶高產(chǎn)菌株，分別為388#、304#、81#、295#、94#、71#、88#、366#、21#、270#、206#菌株。具體結(jié)果見圖2。

圖2 芽孢桿菌菌種庫中中性蛋白酶高產(chǎn)菌株的胞外酶活Fig.2 Extracellular enzyme activity of high-yield neutral protease strains in Bacillus strains library

由圖2可知，對照菌株復(fù)合蛋白酶生產(chǎn)菌株BAP和模式菌株168的胞外中性蛋白酶活力也在100 U/mL以上，同時可以看出菌種庫中篩選到的12株高產(chǎn)菌株均高于菌株168的胞外酶活，10株甚至高于生產(chǎn)菌株BAP，其中388#菌株的胞外中性蛋白酶酶活最高為446.10 U/mL，并且388#菌株的胞外中性蛋白酶酶活是生產(chǎn)菌株BAP的4.0倍，顯示了新中性蛋白酶生產(chǎn)菌株的開發(fā)潛力。

2.3 堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選

對217株可產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株進行了24 h發(fā)酵，對比其胞外酶活，并且以復(fù)合蛋白酶生產(chǎn)菌BAP和堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株1016為對照菌株，篩選獲得高產(chǎn)堿性蛋白酶的野生芽孢桿菌菌株，結(jié)果見圖3。

圖3 芽孢桿菌菌種庫中堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶情況Fig.3 Enzyme production of high-yield alkaline protease strains in Bacillus strains library

由圖3可知，芽孢桿菌菌種庫中存在22株堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株，分別為235#、304#、303#、295#、276#、305#、108#、360#、197#、382#、106#、321#、39#、78#、116#、70#、223#、41#、358#、234#、280#菌株，并且有19株產(chǎn)酶能力高于對照菌株，其中235#菌株酶活最高達336.76 U/mL，分別是菌株BAP和菌株1016胞外堿性蛋白酶酶活的3.2倍和3.1倍，顯示了開發(fā)堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株的潛力。另外，304#菌株堿性蛋白酶酶活達322.31 U/mL，在圖2中304#菌株也是中性蛋白酶高產(chǎn)菌株，可見304#菌株是一株產(chǎn)蛋白酶種類豐富的菌株，可作為菌株BAP的替代菌株進行開發(fā)，也將具有良好的應(yīng)用價值。

2.4 產(chǎn)新型糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的篩選

圖4 芽孢桿菌菌種庫中高底物轉(zhuǎn)化率菌株Fig.4 Strains with high substrate conversion rate in Bacillus strains library

圖5 菌株BAP胞外蛋白催化的糖基轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.5 Results of glycosyl conversion of strain BAP catalyzed by extracellular protein

圖6 菌株114#胞外蛋白催化的糖基轉(zhuǎn)化結(jié)果Fig.6 Results of glycosyl conversion of strain 114# catalyzed by extracellular protein

應(yīng)用糖基轉(zhuǎn)移酶合成糖苷類化合物成為當(dāng)前的一個研究熱點，糖基轉(zhuǎn)移酶是通過天然產(chǎn)物合成糖苷類化合物的關(guān)鍵酶[22]，相關(guān)報道證明，甜菊糖經(jīng)糖基化后產(chǎn)物的甜度都得到了提高[23]。本研究以甜菊苷（St）和萊鮑迪苷A（RA）為底物，對菌種庫中335株菌株的胞外發(fā)酵液進行篩選鑒定，得到了12株高底物轉(zhuǎn)化率的菌株（見圖4），這些菌株的底物轉(zhuǎn)化率都在50%以上，說明這些菌株的胞外發(fā)酵液中具有以St或RA為底物的糖基轉(zhuǎn)移酶。其中對照菌株BAP胞外酶的催化產(chǎn)物在210 nm處有萊鮑迪苷D（RD）的吸收峰（見圖5），菌種庫中菌株114#的胞外酶催化產(chǎn)物在210 nm處有萊鮑迪苷E（RE）的吸收峰出現(xiàn)（見圖6），表明這兩株菌株至少產(chǎn)生一種糖基轉(zhuǎn)移酶，可將底物St或RA轉(zhuǎn)化為特定的產(chǎn)物RD或RE，這在甜味劑研究領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛應(yīng)用前景，并且芽孢桿菌來源的新型糖基轉(zhuǎn)移酶在酶的制備成本上將顯示巨大的成本優(yōu)勢。另外，其他高底物轉(zhuǎn)化率的菌株，雖然沒有檢測到特定產(chǎn)物，至少說明其胞外具有以St和RA為底物的糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生，可能受限于本實驗的檢測條件，沒有檢測到產(chǎn)物，但這些菌仍然顯示了新型糖基轉(zhuǎn)移酶的巨大開發(fā)潛力。

2.5 芽孢桿菌菌種庫中菌株胞外蛋白分泌情況分析

本研究對菌種庫中各菌株的胞外蛋白分泌能力進行了逐一測定，經(jīng)過胞外蛋白濃度及SDS-PAGE的綜合檢測分析，結(jié)果見圖7。

圖7 芽孢桿菌菌種庫中菌株胞外蛋白分泌情況Fig.7 Extracellular protein secretion of strains in Bacillus strains library

由圖7可知，在菌種資源庫中發(fā)現(xiàn)了87株胞外蛋白分泌能力相對突出的芽孢桿菌菌株，占比僅為26%，可見，并不是所有芽孢桿菌都具有高水平的胞外蛋白分泌能力。其中，在這87株總蛋白分泌能力突出的菌株中有16株菌具有高產(chǎn)特定蛋白的能力（見圖8），其胞外蛋白中有1-2個分泌相對突出的特異蛋白條帶，針對這些特異條帶可做進一步的蛋白鑒定，從而鑒定獲得某種蛋白的高產(chǎn)菌株。結(jié)合本研究的高產(chǎn)菌株篩選結(jié)果，在這16株菌株中，295#菌為同時高產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶的菌株，其SDS-PAGE圖中恰好顯示有兩條胞外高分泌水平的蛋白，顯示了進一步研究開發(fā)潛力；12#菌和114#菌經(jīng)前期篩選鑒定為新型糖基轉(zhuǎn)移酶的高產(chǎn)菌株；237#菌為中性蛋白酶高產(chǎn)菌株；均顯示了良好的研究開發(fā)潛力。

圖8 高效分泌特異蛋白的芽孢桿菌胞外蛋白電泳圖Fig.8 Electrophoretogram of extracellular proteins of Bacillus strains with efficiently secretion specific proteins

3 結(jié)論

本研究通過對實驗室小型野生芽孢桿菌菌種庫各菌株產(chǎn)酶情況及胞外分泌能力的逐一測定，成功篩選到12株中性蛋白酶高產(chǎn)菌株、22株堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株，還有68株蛋白酶缺失菌株，這些結(jié)果對于構(gòu)建高產(chǎn)酶制劑生產(chǎn)菌株或是構(gòu)建高效表達系統(tǒng)具有重要意義。同時，通過對糖基轉(zhuǎn)移酶的篩選得到13株高底物轉(zhuǎn)換率菌株包括有目的產(chǎn)物RE生成的114#菌株和RD生成的BAP菌株，這對于利用生物技術(shù)法合成新型甜味劑的研究來說具有一定的意義，也表明這些菌株將在食品市場上有一定的應(yīng)用前景。可見，本實驗室的小型芽孢桿菌菌種庫具有良好的菌株多樣性，將適合于多種食品酶制劑的篩選和開發(fā)。