賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵液中酵母的多樣性研究

張文霞，田亞楠，孫 悅，張秀艷

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；3.寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021）

葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)主要來源于葡萄本身的香氣和由酵母發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[1-3]。為獲得優(yōu)質(zhì)葡萄酒，發(fā)揮各葡萄品種的優(yōu)良品質(zhì)，選用合適的酵母菌十分重要[4-7]。一般都采用商業(yè)化酵母進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵，商業(yè)化酵母的使用與傳統(tǒng)的自然發(fā)酵相比有明顯的優(yōu)勢，可以提高葡萄酒生產(chǎn)的安全性，發(fā)酵過程容易控制，保證葡萄酒最終的質(zhì)量[4]。然而商業(yè)化酵母的使用，使葡萄酒產(chǎn)區(qū)風(fēng)格特征不明顯，產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重。本土酵母已適應(yīng)本地的微環(huán)境，易于在葡萄酒發(fā)酵中起到主導(dǎo)作用，更重要的是，使用本土酵母釀造的葡萄酒可以保證產(chǎn)區(qū)的典型特色[5]。

寧夏賀蘭山東麓作為中國主要的葡萄酒產(chǎn)區(qū)之一，擁有典型的氣候特征、獨(dú)特的地理環(huán)境，蘊(yùn)藏著豐富的酵母資源，已有大量研究人員在賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)區(qū)的酵母菌資源分離、鑒定方面開展了一定的研究工作[8-13]，但賀蘭山產(chǎn)區(qū)酵母資源數(shù)量龐大、種類豐富，仍存在很多未知、待開發(fā)的優(yōu)良酵母。因此，開展對(duì)寧夏賀蘭山產(chǎn)區(qū)葡萄酒酵母的分離、鑒定及多樣性分析對(duì)展現(xiàn)寧夏產(chǎn)區(qū)葡萄酒的地域特征將具有重要意義。

為了分析寧夏賀蘭山東麓葡萄自然發(fā)酵液中酵母多樣性，本研究擬從寧夏賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)（廣夏、立蘭、銀川和紅寺堡）葡萄酒自然發(fā)酵不同階段分離酵母菌，并采用WL培養(yǎng)基與26S rDNA D1/D2序列分析法對(duì)分離酵母菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)發(fā)酵過程中的酵母多樣性進(jìn)行分析。寧夏賀蘭山東麓葡萄自然發(fā)酵汁中酵母的多樣性分析不僅為該產(chǎn)區(qū)酵母的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，也將為其他產(chǎn)區(qū)酵母篩選提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料葡萄樣品：采集于賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)（廣夏、立蘭、銀川和紅寺堡）四個(gè)不同葡萄種植基地。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉、胰蛋白胨（均為生化試劑）、葡萄糖、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鐵、硫酸錳、溴甲酚綠（均為化學(xué)純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose agar，YPDA）培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉1.50 g/L，自然pH值，蒸餾水1 L。121 ℃濕熱滅菌20 min。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制：

母液：胰蛋白胨5 g/L，酵母浸粉4 g/L，葡萄糖50 g/L，瓊脂20 g/L。

儲(chǔ)液A：磷酸二氫鉀5.5 g，氯化鉀4.25 g，氯化鈣1.25 g，硫酸鎂1.25 g，溶于200 mL蒸餾水，高壓滅菌后4 ℃保存。使用時(shí)按2 mL/100 mL加入。

儲(chǔ)液B：氯化鐵0.25 g，硫酸錳0.25 g，溶于100 mL蒸餾水，高壓滅菌后4 ℃保存。使用時(shí)按100 μL/100 mL加入。

儲(chǔ)液C：0.088 g溴甲酚綠溶解于4 mL體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液中（配制體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液時(shí)所用的器皿和蒸餾水都需要高壓滅菌），使用時(shí)按100 μL/100 mL加入。

按比例將儲(chǔ)液A和儲(chǔ)液B加入母液中，pH 6.5左右，121℃滅菌20min，冷卻至65℃加入儲(chǔ)液C，混勻倒平板備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IF超凈工作臺(tái)：蘇中凈化設(shè)備有限公司；GI80TR立式滅菌鍋：美國致微儀器有限公司；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；WD-9413B凝膠成像分析儀、DYY-8C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；T960型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀；杭州博日科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄酒的自然發(fā)酵

將采集的葡萄進(jìn)行破碎、除梗，送入130 L發(fā)酵罐后開始低溫浸漬12 h，后在28 ℃靜置發(fā)酵，待殘?zhí)墙抵? g/L時(shí)，即主發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 不同產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵液中酵母菌的分離

在自然發(fā)酵葡萄汁中，分別取發(fā)酵初期、中期、晚期的發(fā)酵液，采用稀釋涂布法將發(fā)酵液涂布于YPDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，隨機(jī)挑取20～30個(gè)菌落，劃線分離單菌株后轉(zhuǎn)接至YPDA斜面培養(yǎng)基，4 ℃保藏備用。同時(shí)用體積分?jǐn)?shù)20%甘油保藏酵母液體培養(yǎng)液，-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 酵母菌株的初步形態(tài)分類

將保藏的酵母菌株接種于YPDA培養(yǎng)基上，28 ℃靜置培養(yǎng)2 d，挑取單菌落，并劃線接種于WL培養(yǎng)基上，28 ℃靜置培養(yǎng)4～6 d后觀察并記錄菌落顏色和形態(tài)，對(duì)菌株進(jìn)行初步分類。

1.3.4 酵母菌株基因組DNA提取

根據(jù)WL培養(yǎng)基的初步形態(tài)分類結(jié)果，在每一類型中隨機(jī)挑選1～3株酵母菌，制備PCR的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）模板，提取方法參照石英砂振蕩破壁法[14-15]。

1.3.5 酵母菌株26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析

采用正向引物NL-1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'），反向引物NL-4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）擴(kuò)增26S rDNA D1/D2區(qū)序列。26S rDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增體系50 μL：引物NL-1，NL-4（10 μmol/L）各3 μL，10×PCR緩沖液（含Mg2+）5.0 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）4.0 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 U，DNA模板（250 ng/μL）1 μL，最后加雙蒸水定容至50 μL[16]。

PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目標(biāo)條帶，若在600 bp左右出現(xiàn)目標(biāo)條帶，則將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化和測序。將測序得到的序列對(duì)照序列圖譜進(jìn)行人工校正，校正后的序列提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI），在Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源序列比對(duì)，找出相似性較高的核酸序列，確定與模式菌種相匹配的供試菌株的種類。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及分析

實(shí)驗(yàn)采用Microsoft Office 2016和GraphPad Prism 6.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株的形態(tài)分類

從不同產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵過程中共分離316株酵母，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。不同酵母菌在WL培養(yǎng)基（28 ℃培養(yǎng)4～6 d）上的菌落形態(tài)差異顯著，具體見圖1。根據(jù)所分離酵母菌在WL培養(yǎng)基上的顏色和形態(tài)的差異，可將這316株酵母菌初步分為14種，每種的菌落形態(tài)描述見表2。

表1 不同產(chǎn)區(qū)的葡萄自然發(fā)酵過程中分離酵母菌的數(shù)量Table 1 Number of yeast strains isolated from spontaneous fermentation processes in different grape regions

圖1 自然發(fā)酵液中分離到的酵母菌在WL培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.1 Colony morphology of yeasts isolated from spontaneous fermentation grape juice on WL medium

表2 自然發(fā)酵葡萄汁中分離到的酵母在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)描述Table 2 Description of colony morphology of yeasts isolated from spontaneous fermentation grape juice in WL medium

2.2 酵母菌株26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析

隨機(jī)挑選表2中每種類型的酵母1～3株，共挑取31株酵母。按照方法1.3.4和1.3.5分別提取基因組、擴(kuò)增26S r DNA D1/D2序列，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果見圖2，擴(kuò)增產(chǎn)物的測序和分析比對(duì)結(jié)果見表3。由圖2可知，31株酵母的26Sr DNA D1/D2序列堿基大小為500～750 bp。

圖2 酵母菌株26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證Fig.2 Validation of amplification products of 26S rDNA D1/D2 region sequence of yeast strains

表3 葡萄自然發(fā)酵中酵母菌的26S rDNA D1/D2序列分析結(jié)果Table 3 Analysis results of 26S rDNA D1/D2 sequence of the yeast isolated from spontaneous fermentation of grape

由表3可知，在WL培養(yǎng)基上顯示菌落形態(tài)不同的14種類型的酵母菌，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列驗(yàn)證被歸為6個(gè)屬的9個(gè)種。形態(tài)I和形態(tài)IX在WL培養(yǎng)基上顏色相同，形態(tài)略有差別，形態(tài)I表面光滑，而形態(tài)IX表面褶皺，鑒定結(jié)果顯示兩者均為美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）。形態(tài)II中隨機(jī)挑選的4株酵母菌，經(jīng)分子鑒定后均為Candida zemplinina，形態(tài)與分子鑒定結(jié)果較一致。另外，形態(tài)VII、VIII、X、XII和XIV的分子鑒定結(jié)果分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、Candida californica和Pichia galeiformis。形態(tài)III、IV、V、VI和XIII經(jīng)序列比對(duì)后同屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。然而，從形態(tài)XI中隨機(jī)挑選的3株酵母菌，經(jīng)序列比對(duì)后，其中兩株同屬釀酒酵母（S.cerevisiae），而另一株則鑒定為戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）。

2.3 不同產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌動(dòng)態(tài)分析

為了探討不同酵母在不同產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵汁中的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)已鑒定的9種酵母在不同產(chǎn)區(qū)、不同發(fā)酵時(shí)間的分離比例進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖3。

由圖3A可知，在廣夏產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵過程中共分離到4種酵母菌，分別為C.zemplinina、有孢漢遜酵母（H.uvarum）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）和釀酒酵母（S.cerevisiae），它們都出現(xiàn)于發(fā)酵的第1天，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，到發(fā)酵第3天未分離到美極梅奇酵母（M.pulcherrima）。同樣地，C.zemplinina和有孢漢遜酵母（H.uvarum）的生長分別在第5天和第7天被明顯抑制，直至發(fā)酵結(jié)束也未分離到。C.zemplinina、有孢漢遜酵母（H.uvarum）和美極梅奇酵母（M.pulcherrima）主要存在于發(fā)酵前期，并且以有孢漢遜酵母（H.uvarum）為優(yōu)勢菌種，釀酒酵母（S.cerevisiae）存在于整個(gè)發(fā)酵過程中，并且在發(fā)酵中期和后期占主導(dǎo)地位，且釀酒酵母（S.cerevisiae）在發(fā)酵第7天的分離比例達(dá)到100%，直至發(fā)酵結(jié)束，這與張春芝等[9]的報(bào)道結(jié)果一致。

圖3 不同產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌種類及分離比例Fig.3 Yeast species and its isolation proportion during spontaneous fermentation of grape in different wineries

由圖3B可知，在立蘭產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵過程中共分離到6種酵母菌，分別為C.zemplinina、有孢漢遜酵母（H.uvarum）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）、克魯維畢赤酵母（P.kluyveri）、庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和釀酒酵母（S.cerevisiae）。發(fā)酵第1天，共分離到6個(gè)種的酵母菌，其中以有孢漢遜酵母H.uvarum為優(yōu)勢菌種；從發(fā)酵第3天的不同菌株的分離比例可以看出，有孢漢遜酵母（H.uvarum）和釀酒酵母（S.cerevisiae）成為此時(shí)發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌種。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，釀酒酵母（S.cerevisiae）逐漸顯示出比有孢漢遜酵母（H.uvarum）更強(qiáng)的生長優(yōu)勢，發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液中只分離到釀酒酵母（S.cerevisiae）。

由圖3C可知，在銀川產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵過程中共分離到7種酵母菌，分別為C.zemplinina、有孢漢遜酵母（H.uvarum）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）、克魯維畢赤酵母（P.kluyveri）、庫德里阿茲威氏畢赤酵母（P.kudriavzevii）、釀酒酵母（S.cerevisiae）和戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii）。在第1天的發(fā)酵液中分離到5個(gè)種的酵母菌，分別為C.zemplinina、有孢漢遜酵母（H.uvarum）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）、庫德里阿茲威氏畢赤酵母（P.kudriavzevii）和釀酒酵母（S.cerevisiae），其中以有孢漢遜酵母（H.uvarum）和美極梅奇酵母（M.pulcherrima）為優(yōu)勢菌種。到發(fā)酵第5天又新增克魯維畢赤酵母（P.kluyveri）和戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii），此時(shí)發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌種為有孢漢遜酵母（H.uvarum）和釀酒酵母（S.cerevisiae）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，釀酒酵母（S.cerevisiae）逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，直至發(fā)酵結(jié)束，釀酒酵母（S.cerevisiae）的分離比例達(dá)到100%。

由圖3D可知，在紅寺堡產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵過程中共分離到7種酵母菌，分別為C.californica、C.zemplinina、有孢漢遜酵母（H.uvarum）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）、畢赤酵母（P.galeiformis）、克魯維畢赤酵母（P.kluyveri）和釀酒酵母（S.cerevisiae）。在第1天的發(fā)酵液中分離到有孢漢遜酵母（H.uvarum）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）和克魯維畢赤酵母（P.kluyveri），其中以有孢漢遜酵母（H.uvarum）為優(yōu)勢菌種。發(fā)酵第3天新增C.zemplinina，此時(shí)有孢漢遜酵母（H.uvarum）仍然是優(yōu)勢菌種。發(fā)酵第5天開始分離到釀酒酵母（S.cerevisiae）并成為后期的優(yōu)勢酵母。SAEZ J S等[17]在檢測出現(xiàn)異味的葡萄酒中的腐敗酵母物種時(shí)，發(fā)現(xiàn)P.galeiformis能夠產(chǎn)生高濃度揮發(fā)酚，降低葡萄酒的品質(zhì)。TRISTEZZA M等[18]還在葡萄酒發(fā)酵過程中檢測到P.galeiformis能夠產(chǎn)生組胺和尸胺，破壞葡萄酒。因此，P.galeiformis被認(rèn)為是葡萄酒中的腐敗酵母，在篩選適用于葡萄酒釀造的酵母菌種時(shí)應(yīng)當(dāng)將其剔除。

葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌的種類及比例總體呈現(xiàn)一個(gè)此消彼長的動(dòng)態(tài)過程。從4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的葡萄發(fā)酵過程中均分離到有孢漢遜酵母（H.uvarum）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）、C.zemplinina和釀酒酵母（S.cerevisiae）這4種酵母菌，其中在發(fā)酵前期以有孢漢遜酵母（H.uvarum）為優(yōu)勢菌種，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，釀酒酵母（S.cerevisiae）在發(fā)酵中占主導(dǎo)地位，甚至到發(fā)酵結(jié)束時(shí)分離比例達(dá)到100%。有孢漢遜酵母（H.uvarum）是葡萄酒自然發(fā)酵初期存在最為廣泛的一種酵母菌，KATHARINA Z等[19-20]均從葡萄酒自然發(fā)酵過程中分離到該菌。此外，在立蘭、銀川和紅寺堡產(chǎn)區(qū)均分離到克魯維畢赤酵母（P.kluyveri），而庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）僅存在于立蘭和銀川產(chǎn)區(qū)。除了上述分離比例相對(duì)較高的幾種酵母菌外，在銀川產(chǎn)區(qū)葡萄自然發(fā)酵液中還分離到戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii），在紅寺堡產(chǎn)區(qū)葡萄汁自然發(fā)酵液中分離到C.californica和P.galeiformis。

3 結(jié)論

從廣夏、立蘭、銀川和紅寺堡四個(gè)產(chǎn)區(qū)的葡萄自然發(fā)酵過程中共分離到316株酵母菌，采用WL培養(yǎng)基形態(tài)分類和26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析進(jìn)行菌種鑒定。將其歸為9個(gè)種，分別為美極梅奇酵母（M.pulcherrima）、C.zemplinina、庫德里阿茲威氏畢赤酵母（P.kudriavzevii）、克魯維畢赤酵母（P.kluyveri）、C.californica、P.galeiformis、戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii）、有孢漢遜酵母（H.uvarum）和釀酒酵母（S.cerevisiae）。各產(chǎn)區(qū)的酵母種類和數(shù)目均有一定的差異性。而在自然發(fā)酵的整個(gè)過程中有孢漢遜酵母（H.uvarum）和釀酒酵母（S.cerevisiae）占據(jù)主導(dǎo)地位。有孢漢遜酵母（H.uvarum）是發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌種，釀酒酵母（S.cerevisiae）在發(fā)酵中后期逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位直至發(fā)酵結(jié)束。了解葡萄產(chǎn)區(qū)不同來源酵母的分布及在發(fā)酵不同時(shí)期的分離情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析對(duì)葡萄酒的釀造具有重要指導(dǎo)意義，今后可對(duì)分離的酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵性能測定，篩選出適用于釀酒的優(yōu)良酵母，更好地服務(wù)于葡萄酒產(chǎn)業(yè)。本試驗(yàn)已經(jīng)為廣夏、立蘭、銀川和紅寺堡四個(gè)產(chǎn)區(qū)本土化酵母菌的篩選和發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)分析進(jìn)行初步研究，這不僅為寧夏賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)區(qū)酵母的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)，也將為其他產(chǎn)區(qū)酵母篩選提供參考依據(jù)。