支氣管肺泡灌洗液病原菌檢測方法及其在兒童肺炎診治中的應(yīng)用進(jìn)展

李香凝，王金堂

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000

肺炎是我國5歲以下兒童死亡的主要原因之一，發(fā)病急，進(jìn)展快，病程長，以發(fā)熱、咳嗽、咳痰等為主要臨床癥狀，其病原菌包括細(xì)菌、病毒、非典型病原菌（如支原體、衣原體等）和真菌，感染方式包括單一病原菌感染和混合感染，混合感染在肺炎病原菌感染中占重要比例［1］，常引起臨床癥狀嚴(yán)重的肺炎［2］，對患兒的健康生命和家庭負(fù)擔(dān)造成極大威脅。臨床早期治療肺炎多采用經(jīng)驗性用藥，但因為近年抗生素的廣泛使用，小兒肺炎致病菌對抗生素的耐藥性越發(fā)嚴(yán)重［3］，多重耐藥菌株感染率也逐年升高［4］，對于病程較長和免疫低下的肺炎患兒還需警惕真菌感染，這均可導(dǎo)致早期經(jīng)驗性用藥無效，加快病情進(jìn)展，預(yù)后不良。早期快速診斷病原菌，針對性合理用藥，可有效提高肺炎患兒尤其是重癥、難治性肺炎及經(jīng)驗性用藥無效的肺炎患兒的治療療效，從而達(dá)到緩解病情，改善預(yù)后，降低住院率及30天內(nèi)病死率的目的［5］。已研究顯示［6］支氣管肺泡灌洗液（BALF）為標(biāo)本檢測病原菌的特異度、靈敏度、檢出率及標(biāo)本合格率均高于痰液。運用纖維支氣管鏡管道的柔軟性到達(dá)肺部病灶處收集灌洗液作為標(biāo)本，在一定程度上避免了口腔定植菌的干擾，增加了標(biāo)本的可靠性和合格率，從而增加了病原菌的檢出率［7］。兒童肺炎支氣管肺泡灌洗液病原菌檢測方法主要有4種：使用培養(yǎng)基進(jìn)行病原分離培養(yǎng)的病原菌培養(yǎng)法、對特定病原菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR法）、新型恒溫病原菌核酸擴(kuò)增的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）和基于高通量直接檢測病原菌核酸的宏基因二代測序（mNGS），這4種檢測方法對小兒肺炎的病原菌診斷、指導(dǎo)用藥和評估治療療效均具有重要意義，但各自有不同的優(yōu)勢和局限性?，F(xiàn)對支氣管肺泡灌洗液病原菌檢測方法及其在兒童肺炎診治中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 病原菌培養(yǎng)法在兒童肺炎診治中的應(yīng)用

傳統(tǒng)病原菌培養(yǎng)法是將灌洗液標(biāo)本接種到培養(yǎng)皿上，置于35℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基菌落生長并篩選分離可能的致病菌進(jìn)行鑒定，且在培養(yǎng)出菌落后，進(jìn)行藥敏試驗，檢測菌株對相應(yīng)藥物的敏感性和耐藥性。整個操作過程復(fù)雜，耗時較長，要求無菌環(huán)境，需避免外界細(xì)菌污染標(biāo)本或致病菌污染環(huán)境。不同的病原菌適用的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)條件和操作均不同，這就需要操作人員具備扎實的理論知識和專業(yè)熟練的操作技能。培養(yǎng)法是兒童肺炎BALF病原菌檢查方法中最常用的檢測技術(shù)。

BALF培養(yǎng)法檢出病原菌是肺炎病原菌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在肺炎病原菌診斷中應(yīng)用最為廣泛長久，具有深厚的實驗研究基礎(chǔ)，且費用不高，是肺炎患兒入院后的基礎(chǔ)檢查。但患兒在取標(biāo)本前早已使用過抗生素，常導(dǎo)致標(biāo)本培養(yǎng)陽性率低，且培養(yǎng)法操作復(fù)雜，要求嚴(yán)格，標(biāo)本在培養(yǎng)全過程中易受污染，這就對標(biāo)本取樣合格、培養(yǎng)環(huán)境及操作人員操作技術(shù)具有較高的要求，導(dǎo)致培養(yǎng)法病原菌檢出率低。吳巧等［8］、張小華等［9］、宋衛(wèi)娜等［10］的研究顯示灌洗液培養(yǎng)病原菌檢出率分別為53.3%（32/60）、47.7%（51/107）、21.1%（48/228），吳巧等、張小華等的研究檢出率高于宋衛(wèi)娜等研究的檢出率，這可能與研究的患兒年齡、季節(jié)、區(qū)域及操作過程有關(guān)。因部分病原菌難以培養(yǎng)（如鮑特菌、病毒等）和非典型性病原菌（支原體、衣原體等）經(jīng)普通培養(yǎng)方法具有較高的假陰性，導(dǎo)致培養(yǎng)法漏診率較高。且培養(yǎng)法耗時較長，一般細(xì)菌培養(yǎng)需24～48 h，結(jié)核分枝桿菌需培養(yǎng)3～4周，很難達(dá)到早期快速診斷病原菌的需求。

因BALF培養(yǎng)法從標(biāo)本取樣到得出結(jié)果大多超過3 d，無法早期快速診斷病原菌，在肺炎早期治療中沒有太多優(yōu)勢，但培養(yǎng)法在培養(yǎng)出菌落后，可在培養(yǎng)基上對菌落進(jìn)行藥敏試驗，得出菌落對各類抗生素的敏感度和耐藥性，不僅可為病菌耐藥的流行趨勢提供參考依據(jù)，還可為肺炎中期治療抗菌藥物的選擇和調(diào)整提供指導(dǎo)依據(jù)。吳巧等［8］、張小華等［9］、宋衛(wèi)娜等［10］的研究均表明，根據(jù)BALF培養(yǎng)致病菌的種類和藥敏性針對性調(diào)整抗生素使用后，患兒的臨床癥狀和肺部影像學(xué)表現(xiàn)均得到好轉(zhuǎn)，治愈率達(dá)到84.1%～100.0%，平均住院天數(shù)顯著下降，預(yù)后良好。培養(yǎng)法可在治療中期指導(dǎo)調(diào)整抗生素用藥，選擇敏感性較高的藥物針對性治療，不僅可以改善患兒臨床癥狀和預(yù)后，減輕患兒的痛苦和家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可避免抗生素的濫用，降低耐藥菌株和超級細(xì)菌的出現(xiàn)。

2 PCR法在兒童肺炎診治中的應(yīng)用

PCR法是一種無需分離病毒和細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞，只需利用放大擴(kuò)增特定的基因片段來檢測臨床標(biāo)本中的病原菌的檢測方法。因PCR只能應(yīng)對一對引物，檢測一種致病因子，故臨床上常將其與其他技術(shù)進(jìn)行整合檢測病原菌。基于PCR原理的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（mPCR），mPCR是在同一PCR反應(yīng)體系里加入兩對以上引物，可以同時擴(kuò)增多個核酸片段，可同時檢測多種病原微生物。檢測DNA標(biāo)本的為基于熒光檢測的定量實時PCR（Q-PCR），檢測RNA標(biāo)本的為逆轉(zhuǎn)錄定量實時PCR（RT-Q-PCR），臨床上常將多重和實時定量技術(shù)結(jié)合，這體現(xiàn)了高效、簡便、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點，但PCR檢測對環(huán)境及儀器設(shè)備要求較高，無法區(qū)分定植菌和致病菌［11］。

在肺炎病原菌診斷中，PCR技術(shù)是除培養(yǎng)法外最常用的病原菌檢測方法，能夠在較短的時間內(nèi)檢測出多種致病菌的存在，可顯示肺炎感染病菌是單一感染還是混合感染，且不受抗生素使用的影響，為兒童肺炎病原菌診斷提供了一種快速、敏感的診斷方法［12-13］。PCR利用DNA和RNA片段的擴(kuò)增，可有效檢測病毒、細(xì)菌及支原體等，臨床上常用PCR技術(shù)檢測病毒和支原體，在支原體感染診斷中作用尤為突出，將支原體PCR RNA檢測作為肺炎支原體診斷金標(biāo)準(zhǔn)［14］。GUO等［15］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)多重實時熒光PCR技術(shù)，108例患兒BALF病原菌檢出率為78.7%，其中單一病原體感染檢出率48.1%，多重病原體感染率30.6%。謝樂云等［16］采用熒光定量PCR法檢測的149例肺炎患兒BALF，共檢出病原體129例，其中混合感染23例。BALF PCR檢測病原菌的特異度及敏感度高，具有高檢出率。但PCR局限于需要特定目標(biāo)基因的優(yōu)先序列數(shù)據(jù)，依賴特定引物的特異度，只能用于已知基因序列的檢測，對未加入病原菌目的基因的病原菌造成漏診，同時PCR技術(shù)無法區(qū)分定植菌和致病菌，亦不能進(jìn)行藥敏試驗［17］。

PCR技術(shù)因其快速、經(jīng)濟(jì)、病原菌檢出率較高的特點，為肺炎早期治療抗菌藥物的選擇提供重要參考依據(jù)，但其無法檢測致病菌對藥物的敏感性和耐藥性，這對早期治療選擇抗生素的使用存在一定的局限性，無法選擇藥敏性較高的藥物進(jìn)行早期治療，在一定程度上影響肺炎早期治療的療效。通過PCR檢測病原菌，可有效區(qū)分致病菌為病毒、細(xì)菌還是支原體，從而有效選擇治療藥物，避免抗生素的濫用。PCR技術(shù)在兒童肺炎治療療效評估中也具有重要的作用，主要表現(xiàn)在支原體感染后治療的療效評估，支原體DNA的FQ-PCR定量檢測通過其拷貝數(shù)來反映支原體感染患兒的病情，使患兒病情評估得到量化，有助于兒童支原體感染尤其是難治性支原體感染的精準(zhǔn)診療［18］。但若將PCR與培養(yǎng)法結(jié)合，不僅病菌檢出率增高，還可以檢測菌株的藥敏性［19］，對早期肺炎治療療效具有高效保障。

3 LAMP在兒童肺炎診治中的應(yīng)用

LAMP是由NOTOMI等于2000年報道［20］的一種新型快速核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理是通過對目標(biāo)基因的6個特異區(qū)域設(shè)定4種引物，在65℃恒溫條件下依賴一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，生成自我循環(huán)擴(kuò)增的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，使得目標(biāo)基因在短時間內(nèi)大量、高效地擴(kuò)增，無需經(jīng)過模板的加熱變性、長時間溫度循環(huán)、電泳、紫外觀察等過程，僅需1 h即可完成實驗，可用于細(xì)菌、非典型性細(xì)菌（支原體、衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌）、病毒、真菌、寄生蟲和結(jié)核桿菌的快速診斷。LAMP所需設(shè)備簡易，操作簡單，極適用于發(fā)展中國家的病因診斷及傳染病的檢測［21］。

LAMP在小兒肺炎病原菌診斷中常用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒，利用恒溫擴(kuò)增芯片技術(shù)檢測呼吸道常見的13種病原菌，包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、耐甲氧西林葡萄球菌和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，具有較大的診斷價值。LAMP在診斷病原菌時可在1 h內(nèi)完成檢測實驗，2 h內(nèi)可完成從取樣至出結(jié)果全過程，能夠有效達(dá)到早期快速診斷病原菌的目的。LAMP芯片法能從微量拷貝中獲得目的基因，不受抗生素使用的影響，具有較高的檢出率，且LAMP檢測時設(shè)定有Tp值，在一定時間內(nèi)擴(kuò)增拷貝數(shù)達(dá)到一定數(shù)量才可判定為陽性，有效區(qū)分定植菌與致病菌，減少假陽性發(fā)生，還可避免交叉反應(yīng)、免疫抑制狀態(tài)出現(xiàn)假陰性［22-23］。楊雪飛等［24］研究顯示，LAMP病原菌檢出率為56.7%，顯著高于培養(yǎng)的25.0%；研究［25］表明，LAMP比QRT-PCR檢測支原體有更高的敏感性和特異度。LAMP芯片法雖可同時檢測13種常見呼吸道病原菌，但對一些不常見的病原菌造成漏診。但總而言之LAMP芯片法因其耗時短、檢出率高、敏感性高、特異度高及易操作性的優(yōu)點，使得其成為最有前途的即時病原菌診斷方法之一［26］。

LAMP能夠早期快速診斷兒童肺炎病原菌，故對小兒肺炎早期精準(zhǔn)靶向治療具有重要參考價值［26］。WANG等［27］根據(jù)LAMP檢測結(jié)果對16例肺炎患兒調(diào)整藥物靶向治療，所有患兒3 d病情好轉(zhuǎn)，緩解率84.2%。楊雪飛等［24］依據(jù)LAMP檢測結(jié)果對肺炎患兒使用抗生素，抗感染治療時間（14.3±2.9）d，住院時間（14.5±3.2）d，均顯著低于初始治療未覆蓋病原體組，而初始治療有效率86.2%高于初始治療未覆蓋病原體組的40.0%。由此可見，LAMP檢測結(jié)果對肺炎患者早期選擇和調(diào)整藥物后的治療療效具有重要意義。雖然LAMP可檢測出部分菌株的耐藥基因，卻存在無法檢測出菌株對藥物的敏感性的局限性，但總體來說LAMP對于多數(shù)的呼吸道感染病原體能夠有效檢出，具有高于培養(yǎng)法和PCR的特異度和敏感性，有效提高了抗生素治療的覆蓋率和針對性，為兒童肺炎早期治療抗生素的使用提供的重要的參考依據(jù)，且有效避免了抗生素的濫用［28］。

4 mNGS在兒童肺炎診治中的應(yīng)用

mNGS是基于高通量測序技術(shù)主要運用于臨床檢測病原菌的方法，無需培養(yǎng)，能無偏移地將標(biāo)本中所有病原體的核酸都檢測出來，可有效避免漏檢。高通量測序技術(shù)理論上能檢測所有已知病原體，較其他檢測方法測序通量更高，測序速度更快，可早期、快速、精準(zhǔn)鑒定兒童肺炎特別是重癥或難治性肺炎的病原菌。mNGS檢測病原菌種類全面，包括細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、衣原體、寄生蟲、螺旋體、立克次體，可檢測出常規(guī)手段無法檢測出的病原菌，且能同時檢測出多種病原體與多重感染的情況。

mNGS結(jié)合了高通量測序的陽性率高和宏基因高靈敏度的優(yōu)點，且不受抗生素及厭氧環(huán)境的限制，在12～24 h內(nèi)獲得結(jié)果［29］，提高細(xì)菌、病毒、真菌及特殊病原體的檢出率，且能夠有效檢出培養(yǎng)法無法檢測出的病原菌［28］，并能檢測多重感染的情況，為兒童肺炎病原菌診斷尤其是疑難、危重、特殊肺炎病原菌診斷提供快速精準(zhǔn)的新方法。柯創(chuàng)宏等［30］發(fā)現(xiàn)，高通量測序法細(xì)菌檢出率和敏感度均高于細(xì)菌培養(yǎng)法。余世慶等［31］認(rèn)為，mNGS和恒溫擴(kuò)增核酸檢測檢出率菌高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，而mNGS檢出率高于LAMP。且在同一BALF標(biāo)本中，mNGS的特異度及靈敏度高于PCR檢測［32］。但也存在一定的局限性，mNGS能檢測出標(biāo)本中的所有微生物，故而不能區(qū)分檢出病原菌的性質(zhì)是否為致病性，需臨床醫(yī)生結(jié)合臨床癥狀及實驗室報告和影像學(xué)檢查做出判斷，且無法檢測病菌的藥敏性［33］。

mNGS對兒童肺炎的早期治療有著重要的意義，尤其是疑難、危重、特殊肺炎，進(jìn)行mNGS檢測后，明確致病微生物，及時調(diào)整治療，可有效改善患者的臨床癥狀，縮短平均住院時長，效果優(yōu)于經(jīng)驗性的“廣覆蓋”治療。BALF mNGS檢測敏感性高、確診快，避免了長期使用及濫用抗菌藥物，實現(xiàn)精準(zhǔn)治療，從而縮短病程，提高救治成功率。研究顯示，通過mNGS早期明確診斷后，調(diào)整治療方案，患者90 d生存率從57.7%提高至83.3%。

綜上所述，肺炎早期的診療中PCR、LAMP和mNGS占據(jù)重要的位置，能夠早期快速診斷病原菌，及時指導(dǎo)藥物治療，但無法檢測致病菌的藥敏性。mNGS的檢出率雖高于其他檢測方法，但存在費用昂貴，要求技術(shù)水平高，對RNA病毒保存不易，真菌和結(jié)核菌提取DNA相對困難等問題，缺乏統(tǒng)一、完善的檢測流程和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的局限性。若能盡早建立完善抗生素耐藥基因庫，進(jìn)一步完善技術(shù)，降低成本，減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并將mNGS與灌洗液培養(yǎng)、PCR、LAMP進(jìn)行平行送檢，形成早期快速診斷體系，可為兒童肺炎早期病原菌診斷和早期精準(zhǔn)治療做出更完善的參考依據(jù)和指導(dǎo)作用。