化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)及其在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

王春瓊，張燕，李苓，陳丹，彭麗娟，曾彥波

（1.云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，昆明 650106； 2.云南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650504）

蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中不可避免地會遭受多種病蟲害危害，致使產(chǎn)量降低、質(zhì)量下降，因此在果蔬生長過程中常需要噴灑農(nóng)藥，以防治病蟲害，但長期不妥當(dāng)、過量噴灑農(nóng)藥，甚至違規(guī)使用國家早已禁用的高毒農(nóng)藥，造成農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問題較為突出，嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全，危害人體健康［1］。隨著人們環(huán)保意識的提高，國內(nèi)外逐漸加強(qiáng)對農(nóng)藥殘留管控，而及時有效地檢測農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量，是農(nóng)藥殘留管控的有效手段［1］。

現(xiàn)行的農(nóng)藥殘留監(jiān)控方法主要依靠實驗室大型分析儀器，存在檢測成本高、專業(yè)性強(qiáng)、分析周期長、結(jié)果反饋滯后等問題［2–6］。農(nóng)藥殘留快速檢測方法［7–10］以酶抑制等理化方法為主，具有檢測速度快、成本低，適合對批量樣本篩查等優(yōu)點，缺點是該方法依賴于顏色變化，受樣品組織液干擾較大，其檢出限和方法靈敏度的進(jìn)一步提高受到了局限。隨著檢測監(jiān)管要求的不斷完善，酶抑制等理化方法已不能滿足現(xiàn)場檢測及監(jiān)管的要求。

1977 年Halmann 等［11］提出化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，經(jīng)過40 年的發(fā)展，該技術(shù)已比較成熟，其原理是在抗原或抗體上標(biāo)記發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，通過反應(yīng)劑激發(fā)發(fā)光物質(zhì)形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體重回穩(wěn)定基態(tài)時釋放出光子，光信號用自動發(fā)光分析儀識別，進(jìn)而測定光強(qiáng)度，以推算待測樣品中抗原或抗體含量。該技術(shù)［12］將免疫與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合，具有靈敏度高、選擇性好、測定范圍廣、操作簡便、成本低廉、快速、易于實現(xiàn)自動化且無放射性污染等優(yōu)點，近年來在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域發(fā)展較快，被稱為第三代免疫技術(shù)。筆者以化學(xué)發(fā)光免疫分析為基礎(chǔ)，綜述了其原理、常見的化學(xué)發(fā)光劑及化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，并對化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了介紹，最后對該領(lǐng)域的研究前景進(jìn)行了展望，旨在為今后農(nóng)藥殘留檢測相關(guān)研究提供參考。

1 化學(xué)發(fā)光劑

標(biāo)記用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)應(yīng)滿足下述條件：①能進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；②偶聯(lián)抗體或抗原后可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定試劑；③偶聯(lián)后仍然保留高的反應(yīng)動力和量子產(chǎn)率；④應(yīng)不影響或極少影響被標(biāo)記物的理化性質(zhì)，尤其是免疫靈敏度。常見的化學(xué)發(fā)光劑有以下幾類：

（1）吖啶酯類發(fā)光物質(zhì)。該類發(fā)光物質(zhì)是一種具有三環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，易氧化，氧化過程無需催化劑。當(dāng)在堿性環(huán)境中氧化時，分子中共價鍵發(fā)生斷裂，首先形成一個二氧酮中間體，進(jìn)而產(chǎn)生電激發(fā)的N-甲基吖啶酮，當(dāng)N-甲基吖啶酮返回到基態(tài)時，于430 nm 處發(fā)射光子。

（2）魯米諾類發(fā)光物質(zhì)。魯米諾及異魯米諾可在6-氨基進(jìn)行烷基取代，制得各種衍生物，其中氨丁基乙基異魯米諾、氨己基乙基異魯米諾和5-氨丁基乙基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮用于化學(xué)發(fā)光免疫測定已取得較理想的結(jié)果。

（3）咪唑類發(fā)光物質(zhì)。主要以咯吩堿為代表，咯吩堿首先在堿性二甲基亞砜水溶液中反應(yīng)，生成過氧化物中間體，進(jìn)而重排，降解，釋放光子信號。

（4）苯酚類發(fā)光物質(zhì)。主要以鄰苯三酚為代表，屬于強(qiáng)還原劑，在催化劑血紅素的催化下，與H2O2反應(yīng)釋放光子信號。

（5）芳基草酸酯類發(fā)光物質(zhì)。該類物質(zhì)發(fā)光反應(yīng)過程是在體系中加入特殊熒光染料，形成熒光載體，在經(jīng)過氧化草酸酯中間體獲取化學(xué)能，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽?，熒光染料的加入極大地提高了發(fā)光效率。

2 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

2.1 化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）法是在抗體或抗原上標(biāo)記化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，通過獲取標(biāo)記物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，推斷被標(biāo)記抗體或抗原的含量。常用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物有魯米諾、異魯米諾及其衍生物，如氨丁基乙基異魯米諾、氨己基乙基異魯米諾、鄰苯三酚和吖啶酯類。該類分析方法具有以下優(yōu)點：①準(zhǔn)確性和精密度高，均可與放射免疫分析（RIA）法相媲美；②靈敏度高，甚至超越RIA；③檢測時間短；④反應(yīng)試劑無毒，性質(zhì)穩(wěn)定；⑤易實現(xiàn)自動化測定；⑥適用性廣。缺點是抗原或抗體被標(biāo)記過發(fā)光物質(zhì)后，會改變免疫反應(yīng)性能，且發(fā)光劑標(biāo)記率重現(xiàn)性較差。

2.2 熒光化學(xué)發(fā)光免疫分析法

熒光化學(xué)發(fā)光免疫分析（FIA）法因受待檢樣品基質(zhì)干擾限制，靈敏度大為降低。引入內(nèi)源光源作為熒光免疫測定的終點檢測信號，可有效改善外源光源散射產(chǎn)生的背景噪聲，從而大幅度提高信噪比，改善熒光檢測的靈敏度。Malant 等［13］利用雙-(2，4，6-三氯苯基）草酸酯（TCPO)–H2O2作為發(fā)光底物，檢測標(biāo)記熒光素的標(biāo)記抗體，檢出限可達(dá)10–11mol／L。但因TCPO 水溶性較差，需要選擇適宜的有機(jī)溶劑，影響了方法的精密度。該方法目前還未見實際應(yīng)用的報道，仍停留在研究階段。

2.3 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法

在傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析中，酶的活性一般通過熒光法或催化光度法檢測，近年來人們采用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)法檢測酶的活性。從標(biāo)記免疫測定來看，化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析（CLEIA）法應(yīng)屬于酶免疫測定范疇，其檢出限低至10–17mol／L，靈敏度優(yōu)于放射免疫分析法。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析相比，CLEIA 法通過化學(xué)發(fā)光檢測酶活性，而不是通過熒光法或催化光度法測定。此外某些特殊的金屬配合物可催化魯米諾進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。Muhammad等［4］曾用Co(II)和Fe(II)的配合物代替酶作為抗原（或抗體）的標(biāo)記物，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫分析，獲得了成功。

2.4 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法

電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種新型檢測方法，既有別于傳統(tǒng)免疫分析法，又不同于普通化學(xué)發(fā)光分析法。ECLIA 法將化學(xué)發(fā)光法與電化學(xué)法巧妙地結(jié)合，具有高效、特異、靈敏、準(zhǔn)確和適用性廣等特點。與CLIA 法不同，ECLIA 法為電催化化學(xué)發(fā)光，是在電極表面發(fā)生的由穩(wěn)定的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)變形成的具有高反應(yīng)活性的發(fā)光反應(yīng)，它是將電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的底物作為電化學(xué)發(fā)光免疫測定中的標(biāo)記物。ECLIA 法的測定模式與酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法相似，分兩個步驟進(jìn)行。以雙抗體夾心法測定抗原為例，首先用三氯聯(lián)吡啶釘［Ru(bpy)2／3+］配合物標(biāo)記抗體作為反應(yīng)物，然后在磁性微球上吸附固相抗體及待檢樣品。［Ru(bpy)2／3+］配合物和三丙胺（TPA)兩種電化學(xué)活性底物作為其發(fā)光反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 化學(xué)發(fā)光免疫分析法在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展

化學(xué)發(fā)光免疫分析法作為一種兼具高靈敏度和高特異性的免疫分析方法，在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域已得到了良好的應(yīng)用。

（1）國外研究進(jìn)展。Hui 等［14］建立了化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法，用于檢測農(nóng)產(chǎn)品中氰基菊酯類農(nóng)藥殘留，在最優(yōu)條件下，測定結(jié)果表明，λ-氰氟菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯的半抑制率（IC50）值分別為4.3、1.9、3.4 ng／mL，與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫方法相比較，該方法靈敏度高，檢測時間短。Tudorache等［15］建立了磁性粒子化學(xué)發(fā)光酶免疫法，用于檢測樣品中的阿特拉津，方法檢出限為3 pg／L，線性范圍為10～1 000 pg／L，IC50為37 pg／L。Waseem等［16］建立了流動注射化學(xué)發(fā)光免疫法，用于檢測天然水中的西草凈，其檢出限為7.5 ng／mL，線性范圍為0.01～2 μg／L，加標(biāo)回收率為97%～104%。Jin 等［17］建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，用于檢測蔬菜和水果中的三唑磷農(nóng)藥，其檢出限為0.063 ng／mL，線性范圍為0.04～5.00 ng／mL，加標(biāo)回收率為67%～122%。Chen 等［18］建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析法，用于檢測蔬菜中的敵敵畏，其線性范圍為5～8 000 ng／L，檢出限為0.42 ng／L，檢測速度比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析快。

（2）國內(nèi)研究進(jìn)展。陳文梅等［19］以甲基對硫磷分子為識別載體，利用甲基對硫磷–過氧化氫–魯米諾發(fā)光體系，建立了流動注射化學(xué)發(fā)光分析法。該方法對甲基對硫磷測定具有專一性，甲基對硫磷的濃度在0.08～60 μmol／L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.996 9，檢出限為0.034 μmol／L。鄒如冰［20］發(fā)現(xiàn)了一種能同時識別殺螟硫磷、甲基對硫磷和對硫磷的特異性寬譜單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立了化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法。該方法能同時測定上述3 種有機(jī)磷農(nóng)藥，比較了間接、直接2 種競爭反應(yīng)模式，確立了最優(yōu)檢測條件。結(jié)果表明，直接競爭法檢測對硫磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷的IC50分別為5.43、1.34、1.24 μg／kg，線性范圍分別為0.39～100、0.10～25、0.10～25 μg／kg；間接競爭法檢測對硫磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷的IC50分別為5.57、2.30、2.62 μg／kg，線性范圍分別為0.39～100、0.39～25、0.39～25 μg／kg，所建方法滿足農(nóng)產(chǎn)品中上述3 種農(nóng)藥殘留的測定要求。

鄧浩等［21］建立了化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法用于檢測蔬菜中的對硫磷，IC50為1.14 μg／L，線性范圍為0.24～15.83 μg／L，檢出限為0.09 μg／L，加標(biāo)回收率為74.6%～121.0%。楊麗華等［22］建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析法，用于檢測農(nóng)產(chǎn)品中的三唑磷，線性范圍為0.16～20 ng／mL，檢出限為0.489 ng／mL，該方法與氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法測定結(jié)果基本一致。歐陽輝［23］建立了一種動力學(xué)分辨免疫分析新方法，可分別在0.6、1 000 s 時收集兩種待檢物的CL信號，用該方法測定吡蟲啉和甲基對硫磷，線性范圍均為1.0～500 ng／mL，檢出限均為0.33 ng／mL。李明潔［24］基于辣根過氧化物酶–魯米諾–過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系，建立了測定甲萘威的化學(xué)發(fā)光免疫分析法，檢出限為0.25 μg／L，線性范圍為0.25～310.3 μg／L，IC50為3.48 μg／L，用該方法對西紅柿、蘋果、柑橘樣品進(jìn)行測定，加標(biāo)回收率為80.0%～107.0%。程燕［25］建立了一種測定農(nóng)產(chǎn)品中毒死婢的化學(xué)發(fā)光免疫分析法，結(jié)果表明，該方法比傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫法線性范圍更寬，靈敏度更高。單云等［26］在抗原上標(biāo)記石墨烯，建立了電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定蔬菜樣品中的噻蟲啉，方法檢出限為0.05 mg／kg，線性范圍為0.1～10 pg／mL。

4 結(jié)語與展望

近年來，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)展迅速，以其獨特的優(yōu)勢在食品安全等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但在應(yīng)用中同樣存在不足，諸如儀器體積龐大、樣品基質(zhì)干擾大、測定小分子物質(zhì)精密度低等。為了進(jìn)一步發(fā)展該技術(shù)，今后的研究方向應(yīng)集中在以下幾個方面：①儀器向微型便捷化發(fā)展；②樣品前處理技術(shù)應(yīng)更加高效，降低基質(zhì)干擾，提高方法的穩(wěn)定性；③提高檢測效率，促進(jìn)CLIA 技術(shù)向多組分檢測發(fā)展；④發(fā)展CLIA 與其它如磁性熒光材料、量子點和多色熒光微球等新型技術(shù)的聯(lián)用技術(shù)，進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用范圍。