供者特異性抗體對兒童肝移植預(yù)后的影響

肖艷麗，李西川，劉偉，劉純，康中玉，孫超，3，馬楠，3，李代紅

1天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2天津市第一中心醫(yī)院；3天津市器官移植重點實驗室

肝臟是人體最大的免疫特惠器官，有觀點認(rèn)為較少發(fā)生排斥反應(yīng)，原因可能是其具有豐富的血管床和雙重供血系統(tǒng)，Kupffur細(xì)胞能夠吸收游離狀態(tài)的免疫球蛋白，可分泌可溶性的HLA分子中和已產(chǎn)生的游離抗體，肝臟損傷后具有強大的再生能力［1-2］。供者特異性抗體（DSA）是指受者接受器官移植或者組織移植后，體內(nèi)產(chǎn)生的針對供者組織抗原的特異性抗體，其產(chǎn)生增加腎移植、心臟移植和肺移植患者排斥風(fēng)險，或?qū)е峦N異體移植失敗［3］。在實際的臨床工作中，一直忽視肝移植受體DSA的監(jiān)測，以及DSA在肝移植后的損害作用。但隨著免疫學(xué)的不斷發(fā)展，DSA在肝移植中的意義已經(jīng)被人們重新認(rèn)識起來。近期國外研究表明，DSA與肝臟的損傷有一定的關(guān)聯(lián)［4］。而在肝移植方面，尤其是兒童肝移植術(shù)后DSA的產(chǎn)生對術(shù)后移植物存活的影響尚未見系統(tǒng)性報道。本研究回顧性分析了50例接受肝移植并在肝穿刺活檢時檢測HLA抗體兒童的臨床資料，分析DSA的產(chǎn)生與肝臟生物化學(xué)指標(biāo)和肝臟組織學(xué)以及移植術(shù)后并發(fā)癥之間是否存在一定相關(guān)性，比較陰性組和陽性組的相關(guān)指標(biāo)，研究供者特異性抗體在小兒肝臟移植中的臨床影響以及如何提高受者長期存活率。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取擇期行肝移植的患兒50例，男28例，女22例；中位年齡1.0歲；先天性膽管閉鎖45例，進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2例，鳥氨酸代謝紊亂2例，Alagille綜合癥1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①在2013—2018年在我中心器官移植科接受親體器官捐獻(xiàn)或已故供體肝移植的兒童患者（18歲以下）；②臨床資料完整，實驗室相關(guān)化驗完整；③進(jìn)行肝穿刺活檢同時檢測HLA抗體；④均有供者的血清或者脾臟標(biāo)本，進(jìn)行HLA分型；⑤隨訪時間12個月以上。移植術(shù)前進(jìn)行了HLA抗體檢測19例?；颊唠S訪時間（33.2±2.97）個月。

1.2 移植手術(shù)、免疫抑制方案和術(shù)后管理 所有患兒均行肝移植，其中親體部分肝移植29例，公民逝世后捐獻(xiàn)器官肝移植21例。移植受者術(shù)中靜脈注射甲潑尼龍10 mg/kg，巴利昔單抗10 mg（體質(zhì)量＜30 kg），術(shù)后第4天給予巴利昔單抗10 mg，進(jìn)行免疫誘導(dǎo)。肝移植術(shù)后第2天開始給予他克莫司，肝移植術(shù)后3個月內(nèi)采用他克莫司聯(lián)合甲潑尼龍的免疫抑制方案，維持他克莫司血藥濃度谷值濃度在7～10 ng/mL，口服甲潑尼龍，劑量為4 mg/d，隨后逐漸減量，至術(shù)后3個月時撤除；術(shù)后3個月后僅單用他克莫司，血他克莫司濃度谷值維持4～6 ng/mL。

1.3 DSA檢測 兒童肝移植術(shù)后患者，在隨訪當(dāng)天抽取肝移植受者的靜脈血3 mL（無添加劑），血液在無菌條件下收集，新鮮時進(jìn)行分離操作，以避免因為不適當(dāng)?shù)拇鎯l件導(dǎo)致假陽性、假陰性反應(yīng)或者樣本污染。全血及時進(jìn)行分離操作，1 000 g離心10 min，分離血清于凍存管，血清在2～8℃不能超過48 h，如果需要存儲超過48 h，則應(yīng)該在-20℃以下溫度保存或-80℃存儲兩年以上。應(yīng)用Luminex液相芯片技術(shù)，依據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行抗HLA抗體SAB檢測，LIFECODES LSA Single Antigen檢測試劑盒選自美國IMMUCOR公司。將待測血清與包被了特異性抗原的微珠加入到Millipore微孔板中，經(jīng)過30 min孵育，若血清中存在HLA抗體則可與微珠上的抗原結(jié)合，利用抽真空方法洗滌除去沒有結(jié)合的抗體或其他雜質(zhì)，再加入PE標(biāo)記的二抗染色，孵育后，通過Luminex平臺獲取特異性結(jié)合微珠的熒光信號，再利用軟件分析得到特異性抗體類型。微球被紅綠染料設(shè)計成深淺不同的熒光編碼，在被激光掃描時測量目的熒光的平均強度（MFI）。我們通過分析軟件獲得MFI的大小，并根據(jù)MFI劃定陰陽性參考范圍。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：MFI＜750陰性；750～4 000弱陽性；4 000～10 000中陽性；＞10 000強陽性。如果多個位點陽性，以MFI值最高的為主，抗體特異性通過與供體配型比對，確定是否為DSA。

1.4 肝臟纖維化活檢 受者進(jìn)行HLA抗體檢測同時進(jìn)行肝穿刺活檢，經(jīng)全身麻醉和局部消毒后，在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行肝活檢，在受者腋中線或腋前線第7～9肋間隙的肝濁音區(qū)穿刺獲取1條完整肝活檢組織，要求1條組織長度＞1 cm最滿意，每例樣本觀察6個組織切面，所有病例通過免疫熒光或免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行常規(guī)蘇木素和伊紅、Masson三色和補體4d（C4d）染色。依據(jù)Banff ACR RAI標(biāo)準(zhǔn)對移植肝T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（T-Cell Mediated Rejection，TC?MR）進(jìn)行評分，將門管區(qū)“三聯(lián)征”按其RAI各計3分，總分為9分。經(jīng)Masson三色和網(wǎng)狀纖維染色評價肝臟纖維化及壞死程度，依照指南［5］對結(jié)果進(jìn)行判定和強度分級。纖維化分級為半定量分級，具體分級：無纖維化記0分，致密周圍和脈絡(luò)膜纖維化記1分，周圍纖維化和非橋聯(lián)門靜脈纖維化記2分，橋聯(lián)纖維化顯示中心到中心橋聯(lián)記3分，廣泛的橋聯(lián)和脈絡(luò)膜纖維化顯示肝硬化記4分。

1.5 肝功能指標(biāo)檢測 晨起空腹時采集受者靜脈血標(biāo)本3～5 mL，標(biāo)本采集送檢后1 000 g離心10 min，分離血清，采用羅氏Cobas c 311全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）及總膽汁酸（TBA），通過HISS系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

1.6 患兒產(chǎn)生DSA時的隨訪時間、存活、并發(fā)癥記錄 記錄產(chǎn)生抗體時的隨訪時間、存活、并發(fā)癥情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以四分位數(shù)間距（非正態(tài)分布）表示，組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；Kaplan-Meier曲線用于事件發(fā)生時間的結(jié)果，并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗組間的生存率差異。肝纖維化評分使用單向有序定性資料的秩和檢驗（Kruskal-Wallis法）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

50例肝移植患兒，DSA陽性者24例（陽性組），全部以抗HLA-Ⅱ類抗體為主，且抗HLA-DQ抗體是主要的抗體；DSA陰性者26例（陰性組）。

陽性組移植肝纖維化12例（50.0%），其中肝纖維化評分0分6例、1分2例、2分3例、3分1例；陰性組移植肝纖維化4例（15.4%），其中肝纖維化評分0分、1分各2例；兩組移植肝纖維化比較，P＞0.05。

陽性組、陰性組血清ALT水平分別為24.40（18.45～73.73）、19.00（17.90～65.00）U/L，血清AST水 平 分 別 為46.50（31.00～54.00）、33.80（27.33～51.78）U/L，血清ALP水平分別為201.50（178.25～338.50）、232.10（136.67～338.42）U/L，血清GGT水平分別為14.50（11.25～26.25）、11.20（7.23～23.11）U/L，血 清TBA水 平 分 別 為8.00（7.08～10.50）、9.11（5.00～25.03）μmol/L，兩組血清AST水平比較，P＜0.05。

陽性組、陰性組產(chǎn)生抗體時的隨訪時間分別為43、17個月，兩組比較，P＜0.05。陽性組、陰性組術(shù)后1年的存活率分比為91.7%（22/24）和96.2%（25/26），兩組比較，P＞0.05。陽性組2例患者死亡，死亡原因為心功能衰竭和呼吸系統(tǒng)衰竭，分別隨訪43、27個月；陰性組1例患者死亡，隨訪13個月，受者抗HLA抗體顯示陰性，但是肝功能指標(biāo)顯示異常增高，于是進(jìn)行了二次肝移植術(shù)。陽性組并發(fā)癥為抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)1例，膽道并發(fā)癥2例，慢性排斥反應(yīng)2例，TCMR 3例，藥物性肝損傷4例；陰性組并發(fā)癥為慢性排斥反應(yīng)1例，TCMR 2例，藥物性肝損傷4例，血管并發(fā)癥5例，膽道并發(fā)癥5例，感染5例。

3 討論

肝移植已經(jīng)成為治療終末期肝病的一種有效的治療方法，幾十年來我國的成人肝移植手術(shù)技術(shù)已逐漸成熟，而對于兒童終末期肝病來說，可以通過活體肝移植或肝DCD移植手術(shù)獲得較理想的效果。隨著兒童肝移植手術(shù)的經(jīng)驗積累和技術(shù)的提高，受者術(shù)后成功率和生存率有明顯的提高，但是術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率仍然較高。尤其對于肝移植受者早期檢測出DSA，避免排斥反應(yīng)的發(fā)生，提高移植后的患者長期存活率，是肝移植長期存活的受體研究中需要關(guān)注的問題。

腎臟移植和心臟移植受者的DSA與急性T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥、抗體介導(dǎo)的排斥進(jìn)展為慢性排斥、晚期移植物功能障礙、血管病變和同種異體移植物丟失有關(guān)［6-7］。而在肝移植，越來越多的證據(jù)表明，DSA的存在與移植后的排斥、纖維化、炎癥有關(guān)。另文獻(xiàn)報道肝移植后DSA患者的比例在8%～67%［8-9］，這些DSA陽性患者中的大多數(shù)是針對II類HLA抗原的抗體［10］。WOZNIAK等［11］報道DSA的患病率約為56%。GRABHORN等［12］報道稱，20例（47%）兒童患者在死亡或活體供體肝移植后有DSA，并且?guī)缀跛械膬和颊叨加蠨SA。研究［13］顯示，在32例DSA陽性患者中，所有患者在各自的肝活檢中都有某種形式的纖維化，而35例DSA陰性患者中有24例患者存在某種形式的纖維化，并且DSA陽性患者的纖維化傾向于嚴(yán)重的分級。在兒童肝移植患者中，DSA的危險因素包括移植年齡較小，移植后生存時間長，爆發(fā)性肝炎病史等［14-16］。KANEKU等［17］發(fā)現(xiàn)，移植術(shù)后新生DSA可顯著降低肝移植受者和移植物的長期存活率。與DSA陰性受者相比，術(shù)后新生DSA陽性的受者1年內(nèi)死亡風(fēng)險增加了1.99倍（P=0.005），移植物功能衰竭風(fēng)險增加了1.85倍（P=0.01）。王永翠等［18］發(fā)現(xiàn)，DSA組與非DSA組術(shù)后1年、2年存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究顯示，兒童移植受者的DSA患病率為48.0%，DSA的類型主要是具有高M(jìn)FI值的二類HLA抗體。本研究結(jié)果與外文文獻(xiàn)陽性率大體一致。研究中DSA陽性患者中有一半患有纖維化，而DSA陰性患者中有15.4%（4/26）患有纖維化，且兩者無統(tǒng)計學(xué)差異，本文的局限性在于納入的研究對象樣本量少，增加了Ⅱ型錯誤的風(fēng)險。我們比較兩組的肝功生物化學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)陽性組的AST數(shù)值表現(xiàn)比陰性組更高，說明DSA對肝移植受者的肝臟功能有一定的影響。只有19例病例在移植前進(jìn)行了PRA的檢測，其他病例未在移植前進(jìn)行抗體檢測，因此對于DSA無法判斷是術(shù)后新生還是術(shù)前預(yù)存，更無法比較新生DSA對于肝移植受者和移植物的存活率的影響。因此，根據(jù)我中心的臨床經(jīng)驗，建議所有的肝移植等待者在評估時進(jìn)行HLA抗體檢測，對于有致敏史的患者，更應(yīng)多次檢測抗體水平。本研究缺少AMR的確診病例，原因可能為臨床上對于AMR的診斷具有一定難度，急性AMR的最終診斷需結(jié)合臨床表現(xiàn)、DSA檢測、組織病理學(xué)和C4d檢測結(jié)果等予以綜合判定，而AMR臨床表現(xiàn)的時間可能早于或晚于移植物損傷出現(xiàn)嚴(yán)重程度的時間。

隨著DSA繼發(fā)同種異體移植損傷的證據(jù)越來越多，在肝臟移植受者的長期管理中進(jìn)行DSA監(jiān)測的問題已經(jīng)被重新認(rèn)識。監(jiān)測實體器官移植后DSA水平的中心指南，數(shù)據(jù)來源大多是基于腎和心臟移植［19］。最近，移植工作組會議報告［20］建議對肝移植受者進(jìn)行常規(guī)DSA監(jiān)測。雖然可能沒有必要對所有肝移植受者進(jìn)行常規(guī)DSA監(jiān)測和常規(guī)移植活檢，但可能有高危肝移植受者群體將受益于移植前和術(shù)后定期DSA篩查。臨床上應(yīng)用血漿置換、利妥昔單抗、抗胸腺細(xì)胞球蛋白、靜脈注射免疫球蛋白和類固醇治療循環(huán)DSA的受體。蛋白酶體抑制劑及其與下一代共刺激阻斷聯(lián)合使用已被證明在腎移植的臨床前模型中是有效的［21-24］。然而，這些新的治療方法在肝移植DSA介導(dǎo)的損傷中的適用性仍有待觀察。

總之，肝移植后DSA對于受者的預(yù)后有一定的影響，未來還需要利用更大規(guī)模的肝移植受體進(jìn)行DSA與病理學(xué)結(jié)果的分析，并思考如何共同利用DSA和其他指標(biāo)，早期預(yù)防排斥反應(yīng)，或制定合理的干預(yù)措施，增加受者生存時間。