晝夜節(jié)律、時鐘基因與慢性腎臟病發(fā)病關系的研究進展

王宜飛，孫倩，夏中元

武漢大學人民醫(yī)院麻醉科，武漢430060

慢性腎臟病(CKD)是多種腎臟疾病的統(tǒng)稱，是由各種原因引起的持續(xù)數(shù)月的不可逆的腎臟結(jié)構和功能異常，主要包括原發(fā)性腎小球疾病、繼發(fā)性糖尿病、高血壓腎病及腎血管性疾病等[1]。近年來由CKD導致的終末期腎病(ESKD)數(shù)量急劇增加，已成為威脅全球公共衛(wèi)生的一大難題[2]。晝夜節(jié)律生物鐘在調(diào)節(jié)機體日常生理活動中起著基礎性作用，腎臟受到中樞生物鐘的調(diào)控。生物鐘的核心時鐘元件由經(jīng)典時鐘基因如晝夜運動輸出周期蛋白(CLOCK)、芳基碳氫化合物受體核易位體樣蛋白1(BMAL1)、周期蛋白(PER1、PER2、PER3)、隱花色素基因家族(CRY1、CRY2)、視黃酸相關孤兒核受體(ROR)α、RORβ和孤兒核受體Rev-Erbα組成，這些核心時鐘基因通過協(xié)同或拮抗作用在細胞內(nèi)周期性表達和(或)激活，維持各種生物活動[3]。越來越多的證據(jù)表明，睡眠問題或其他不良生活習慣引起的晝夜節(jié)律紊亂可能是導致CKD發(fā)生發(fā)展的重要因素?，F(xiàn)就晝夜節(jié)律、時鐘基因與CKD發(fā)病的關系相關研究進展進行綜述。

1 腎臟生理晝夜節(jié)律及晝夜節(jié)律紊亂與CKD發(fā)病的關系

1.1 腎臟生理晝夜節(jié)律 早在19世紀，學者發(fā)現(xiàn)尿液中尿素和水的排泄具有明顯的晝夜節(jié)律性，白天的尿液排泄量明顯比夜間多。隨后，腎臟多個生理功能均被證明具有晝夜節(jié)律，包括腎小球濾過率(GFR)、腎血流量及腎臟水和主要尿溶質(zhì)的排泄，其動力學特征為夜間的低谷和活動期的峰值；GFR和腎血流量的晝夜節(jié)律振蕩幅度在50%左右，而水和電解質(zhì)在活躍期的排泄量可能較夜間高出數(shù)倍。FIRSOV等[3]認為，這可能與腎小管各種電解質(zhì)轉(zhuǎn)運體周期性激活及加壓素受體V1aR、V2R、尿素轉(zhuǎn)運蛋白UT-A2和水通道AQP2基因節(jié)律性表達相關。腎臟作為強大的內(nèi)分泌器官，分泌腎素、促紅細胞生成素、活性維生素D和前列腺素等多種激素。血漿腎素活性與血壓有著相似的節(jié)律，都表現(xiàn)為“晨峰”現(xiàn)象，而促紅細胞生成素的峰值出現(xiàn)在傍晚[4]；前列腺素E2的尿排泄表現(xiàn)為下午最高，夜間最低[5]。這些激素分泌呈現(xiàn)出的節(jié)律性與腎臟的生理功能緊密相關。

1.2 晝夜節(jié)律紊亂與CKD發(fā)病的關系 近年來晝夜節(jié)律紊亂與CKD的聯(lián)系受到廣泛的關注與研究。一項隊列研究表明，長期夜班工作與與鋼鐵工人早期腎功能不全顯著相關[6]。同時流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，睡眠時間過長或過短的人群中患有CKD的比例更高，睡眠時間7～8 h比較合適[7]。針對CKD患者進行的隨訪亦發(fā)現(xiàn)缺乏睡眠或睡眠質(zhì)量下降的CKD患者GFR惡化速度加快，更容易進展至ESKD[8]。糖尿病是導致CKD發(fā)病的重要原因，并且糖尿病腎病一旦確診通常會緩慢發(fā)展為ESKD。時鐘基因可通過調(diào)節(jié)腸道對葡萄糖的吸收，肝臟、肌肉、白色脂肪組織對葡萄糖的代謝，以及胰腺中胰島素的分泌參與維持血糖穩(wěn)定的各個環(huán)節(jié)。因此，晝夜節(jié)律紊亂會導致胰島素抵抗及胰島素分泌模式或分泌量改變，從而導致糖尿病的發(fā)生[9]。此外，高血壓也是CKD發(fā)生并進展至ESKD的重要病因，尤其是平均睡眠收縮壓被認為是CKD最重要的獨立預測因子。平均睡眠收縮壓每降低一個標準差，CKD患病風險降低27%[10]。正常血壓具有明顯的晝夜節(jié)律性，早上醒來時血壓升高，夜晚睡眠時血壓降低，這與環(huán)境、神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦—垂體—腺體軸、血管及腎臟等多個具有節(jié)律性的因素的調(diào)節(jié)有關。因此，晝夜節(jié)律紊亂導致的夜間血壓不降低(非勺型高血壓)與CKD的發(fā)生和進展相關，但潛在的分子機制尚不清楚[5，11]。這些流行病學與病因?qū)W方面的證據(jù)提示晝夜節(jié)律紊亂與CKD的發(fā)生發(fā)展密切相關。

2 時鐘基因與CKD發(fā)病的關系

CKD的病理生理機制相當復雜，目前公認的機制包括自噬失調(diào)、炎癥反應和過度的氧化應激反應，最終導致腎臟纖維化。時鐘基因可能通過調(diào)控以上過程參與CKD的發(fā)病。

2.1 時鐘基因調(diào)控腎臟自噬節(jié)律 自噬是一種保守的溶酶體降解細胞質(zhì)成分的途徑，腎臟細胞內(nèi)的固有自噬是維持腎臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、結(jié)構和功能的關鍵，而自噬失調(diào)參與了急性腎損傷、急性腎損傷后腎臟的不完全修復及多種病因?qū)е碌腃KD[12]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠的mTORC1活化降低可激活自噬，減少足細胞丟失、減輕蛋白尿及腎小球硬化，從而延緩糖尿病腎病的進展[13]。而在單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型中，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)可增強梗阻腎小管細胞凋亡和間質(zhì)纖維化；依舊在UUO模型中，LC3基因敲除小鼠和beclin-1雜合缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠的腎臟表現(xiàn)出TGF-β1導致的膠原蛋白沉積增加，而LC3和beclin-1蛋白均為關鍵的自噬相關蛋白[14-15]。以上證據(jù)表明，適度自噬激活可以抑制腎臟纖維化并延緩CKD的發(fā)生發(fā)展。CZAJA等[16]發(fā)現(xiàn)，肝臟中LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化速率在中午階段達到峰值，隨后黑夜階段下降，說明細胞固有自噬的激活存在明顯的晝夜節(jié)律性。TFEB和TFE3是MiT-TFE轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，作為自噬的關鍵調(diào)節(jié)因子其以晝夜節(jié)律的方式被激活并可直接促進Rev-Erbα表達，而Rev-Erbα抑制Ulk1、Ulk3、Bnip3、Park2、Atg5、Atg7、Bcln1等自噬相關基因的表達，這些基因同時也是TFEB和TFE3激活自噬的靶基因，提示TFEB/TFE3和Rev-Erbα之間的動態(tài)平衡與自噬激活的節(jié)律調(diào)節(jié)有關[17]。因此，深入研究時鐘基因?qū)ψ允晒?jié)律的調(diào)節(jié)，對于明確CKD的發(fā)生發(fā)展機制，尋求新的治療靶點有著重要意義。

2.2 時鐘基因調(diào)控CKD炎癥反應 持續(xù)性低度炎癥狀態(tài)是CKD的顯著特征，以循環(huán)中持續(xù)性低至中度水平的炎癥標志物為特點[18]。一項納入3 430例CKD患者的隊列研究表明，TNF-α、IL-6水平是GFR惡化的獨立預測因子[19]。研究發(fā)現(xiàn)，注射內(nèi)毒素或者D-半乳糖胺(一種肝毒素)的PER1-/-小鼠，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平更高，而Cry1-/-Cry2-/-小鼠脾臟中的T細胞數(shù)量增加，TNF-α水平升高，提示時鐘基因可抑制促炎因子的產(chǎn)生從而減緩CKD的進展[20]。核因子κB(NF-κB)是炎癥信號通路中的關鍵分子，其活化會促進腎臟炎癥反應。腎臟中NF-κB的激活有兩種方式，包括經(jīng)典通路與非經(jīng)典通路，大多數(shù)腎臟疾病中以經(jīng)典通路居多，其以RelA/p50異二聚體發(fā)生核轉(zhuǎn)移為特征。WANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Rev-Erbα可通過特異性結(jié)合RevRE元件抑制RelA的表達，從而抑制NF-κB激活的經(jīng)典通路。NARASIMAMURTHY等[22]也發(fā)現(xiàn),CRY1的缺失會使細胞內(nèi)環(huán)腺苷酸水平增高并增強蛋白激酶A活化，進而造成RelA磷酸化，最終導致NF-κB激活加強。此外，腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導物可以激活以RelB/p52異二聚體的核轉(zhuǎn)移為特點的NF-κB非經(jīng)典通路，從而加重腎小管細胞的炎癥反應，加速CKD的進展[23]。值得注意的是，RelB作為NF-κB的亞單位可直接結(jié)合BMAL1，作為時鐘基因表達的負調(diào)節(jié)因子[24]。因此時鐘基因可以通過對NF-κB激活通路的調(diào)控從而抑制腎臟疾病相關的炎癥反應。近年來，炎癥小體已成為CKD發(fā)病機制相關研究的熱點。炎癥小體是多蛋白復合物，在感染和組織損傷時驅(qū)動促炎因子的產(chǎn)生，其中NLRP3炎癥小體與腎臟疾病的相關性最強[25]。小鼠腹腔巨噬細胞中NLRP3炎癥小體組分的mRNA表達水平呈現(xiàn)節(jié)律性振蕩，在活動期達到頂點，此時為Rev-Erbα mRNA水平最低點，這提示，Rev-Erbα是NLRP3炎癥小體的調(diào)節(jié)因子，可抑制其表達、激活及隨后發(fā)生的IL-1、IL-18的成熟和分泌[26]。綜上，時鐘基因在炎癥反應中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，而晝夜節(jié)律紊亂可能加重腎臟的炎癥反應，從而促進CKD的進展。

2.3 時鐘基因調(diào)控CKD氧化應激反應 早在CKD始發(fā)階段即有氧化應激反應存在，其在腎功能衰竭的發(fā)生機制中占有重要地位。多種促氧化酶激活產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)，同時伴隨抗氧化防御機制即超氧化物歧化酶、過氧化氫酶(CAT)、含硒谷胱甘肽過氧化物酶和對氧磷酶受損，是CKD發(fā)生氧化應激反應失衡的核心機制，ROS過量會通過損傷DNA、脂質(zhì)過氧化以及氨基酸的氧化等對細胞結(jié)構及功能造成損傷[27]。而時鐘基因可調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生和清除。研究發(fā)現(xiàn)，BMAL1敲除的小鼠腎臟、心臟和脾臟中ROS聚集顯著高于野生型小鼠[28]。SENGUPTA等[29]認為，Rev-Erbα能夠促使大鼠肺成纖維細胞線粒體呼吸鏈激活、FoxO1表達增加及其下游抗氧化基因如錳超氧化物歧化酶，血紅素加氧酶1和CAT表達也相應增加，從而起到維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抗氧化應激的作用。KEAP1-NRF2/ARE通路是經(jīng)典的抗氧化應激通路，也是CKD最具前景的治療靶點之一。有學者研究發(fā)現(xiàn)，核心時鐘基因CLOCK和BMAL1能通過啟動子上的E-BOX元件調(diào)控Nrf2及其下游抗氧化應激蛋白的節(jié)律性表達，使其發(fā)揮抗氧化應激作用；亦有研究證實Nrf2通過調(diào)節(jié)BMAL1下游靶點Rev-Erbα的轉(zhuǎn)錄間接抑制BMAL1/CLOCK的表達[30-31]。因此，Nrf2和時鐘基因組成了一個連鎖反應環(huán)，將細胞氧化還原信號整合到生物鐘節(jié)律性變化中。所以時鐘基因通過調(diào)節(jié)抗氧化應激通路控制ROS表達，為減輕CKD氧化應激損傷提供了更多的治療思路。

2.4 時鐘基因調(diào)控腎臟纖維化

2.4.1 時鐘基因與TGF-β1/Smad通路 TGF-β1是主要的促腎臟纖維化因子，在肌成纖維細胞的活化中有重要作用。在經(jīng)典的TGF-β1/Smad信號通路中，TGF-β1直接與細胞表面的TGF-β1Ⅱ型受體結(jié)合，隨之產(chǎn)生的TGF-β1Ⅰ型受體使Smad2、Smad3磷酸化并與Smad4結(jié)合形成異二聚體，隨后異二聚體轉(zhuǎn)移到細胞核中以增加纖連蛋白、α-SMA、膠原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進腎臟的纖維化[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和磷酸化Smad3蛋白在哺乳動物下丘腦視交叉上核中呈節(jié)律性地表達。隨后，CHEN等[33]進一步證實，在BMAL1/CLOCK異二聚體調(diào)控下TGF-β1mRNA表達水平隨晝夜節(jié)律振蕩，并發(fā)現(xiàn)在UUO模型中，CLOCK缺失的小鼠TGF-β1水平增高，腎臟纖維化程度更嚴重。但在一項肺纖維化相關研究中發(fā)現(xiàn)，BMAL1敲除會減少TGF-β1所致的磷酸化SMAD3的產(chǎn)生，從而抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化和肺上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化最終延緩肺纖維化[34]?？梢姇r鐘基因在TGF-β1/Smad通路中所起的作用具有多樣性，這也是未來需要深入研究的問題。

2.4.2 時鐘基因與腎纖維化其他相關信號通路 在腎臟中，Wnt/β-catenin通路激活促進許多纖維化相關基因的表達，如Snail1、纖溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶7和腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)等[35]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性CRY1敲除可以促進β-catenin表達和核積累從而抑制脂肪細胞分化[36]。關于前列腺癌的一項研究也發(fā)現(xiàn)，時鐘基因PER3可抑制腫瘤微環(huán)境中的Wnt/β-catenin信號，負性調(diào)節(jié)前列腺癌干細胞[37]。近年來時鐘基因與Wnt/β-catenin信號通路的研究多局限于腫瘤等領域，而在腎臟病方面的研究較為匱乏，但這也為今后腎纖維化的防治提供了新的研究方向。此外，有學者發(fā)現(xiàn)，Sonic hedgehog(SHH)與PTCH結(jié)合，使得Smo釋放產(chǎn)生級聯(lián)反應，促進轉(zhuǎn)錄因子Gli入核，調(diào)節(jié)纖維化基因表達，導致腎臟纖維化[38]。ZHANG等[39]發(fā)現(xiàn)，在小鼠UUO模型中，BMAL1可與Gli2啟動子結(jié)合，促進Gli2轉(zhuǎn)錄，加重腎臟纖維化，這將時鐘基因和SHH信號通路聯(lián)系了起來。

2.4.3 時鐘基因與PAI-1 PAI-1可抑制纖維蛋白溶解和促進細胞外基質(zhì)沉積。研究表明，在小鼠UUO模型中，特異性敲除腎臟成纖維細胞中的PAI-1基因能夠抑制小鼠腎小管間質(zhì)纖維化，認為這種成纖維細胞源性的分泌因子能促進腎臟纖維化[40]。CARMONA等[41]總結(jié)了時鐘基因調(diào)控PAI-1血液濃度節(jié)律性變化的分子機制：BMAL1/CLOCK二聚體和RORα分別通過啟動子上的E-BOX元件和RORE位點促進PAI-1基因表達，而PER/CRY和Rev-Erbα可競爭性結(jié)合以上位點而抑制PAI-1的表達，從而PAI-1與時鐘基因的晝夜表達曲線非常相似。因此，時鐘基因可通過直接調(diào)節(jié)PAI-1表達而影響腎臟纖維化的發(fā)展。

綜上所述，晝夜節(jié)律在維持腎臟正常生理功能中起著重要作用。時鐘基因表達的節(jié)律性紊亂是CKD的發(fā)生發(fā)展的關鍵機制。同時，CKD患者普遍存在睡眠障礙，進一步增加了發(fā)生晝夜節(jié)律紊亂的可能性。因此，在針對CKD的治療中，晝夜節(jié)律是不可忽視的因素，深入了解時鐘基因在CKD發(fā)生發(fā)展中的分子機制可以為臨床上改進治療策略提供參考。通過改善睡眠以及不良的生活習慣，有助于預防CKD的發(fā)生和惡化。隨著晝夜節(jié)律相關機制的逐步闡明，基于時鐘基因及其相關信號通路的靶點有望為CKD的治療帶來新的曙光。