樹突狀細(xì)胞疫苗治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究進(jìn)展

裴天楚 黃隆 吳國惠 潘文娜 劉嘉敏 潘宣

廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科（廣州510080）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）在頭頸部惡性腫瘤中發(fā)病率最高。腫瘤早期的患者通常接受手術(shù)治療，3年有效生存率可達(dá)92.2%（SE = 1.1），而晚期腫瘤患者接受手術(shù)協(xié)同放療或化療的綜合治療，3年有效生存率只有70.3%（SE = 1.9）［1］。免疫治療作為一種新的治療方案，一方面可以直接補(bǔ)充外源性免疫效應(yīng)細(xì)胞或分子，提高機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答水平，另一方面利用腫瘤免疫的機(jī)制和特點(diǎn)，改變腫瘤細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞的免疫學(xué)特性，調(diào)整機(jī)體免疫應(yīng)答的狀態(tài)，達(dá)到抑制或殺傷腫瘤的目的［2］。目前樹突狀細(xì)胞疫苗在治療一些如黑色素瘤、胃腸道腫瘤、淋巴瘤等腫瘤的過程中取得了可觀的效果［3-4］。

1 樹突狀細(xì)胞是最活躍、扮演角色最多的免疫細(xì)胞

樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）由單核細(xì)胞分化而來，是人體內(nèi)抗原呈遞能力最強(qiáng)的免疫細(xì)胞［5］。按來源可分為髓系DC（myeloid DC，mDC）和漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）兩個(gè)亞群，在整個(gè)免疫應(yīng)答過程中起著至關(guān)重要的作用。pDC 主要通過輔助性T 細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅰ型免疫應(yīng)答，在固有免疫中發(fā)揮重要作用［6］。mDC 在攝取處理抗原后可遷移至二級淋巴組織，從而啟動免疫應(yīng)答并刺激分泌相關(guān)免疫因子參與免疫應(yīng)答的環(huán)節(jié)［7］，制備疫苗選用的mDC 通常由骨髓分離出的單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來。且樹突狀細(xì)胞膜上表達(dá)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，像自然界的蜜蜂一樣在免疫系統(tǒng)里扮演傳播抗原的媒介角色。未成熟DC 具有很強(qiáng)的抗原攝取及加工能力。當(dāng)未成熟DC 在攝取抗原或經(jīng)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）等刺激后逐漸成熟，并表達(dá)共刺激因子（CD80/B7-1、CD86/B7-2 等）和黏附因子，使得抗原呈遞和激活初始T 細(xì)胞的能力增強(qiáng)。DC 還可以提供T 細(xì)胞活化所必須的第二信號，增強(qiáng)NK 細(xì)胞毒作用等［8-9］。

2 樹突狀細(xì)胞在OSCC 患者體內(nèi)處于免疫抑制的狀態(tài)

免疫系統(tǒng)與腫瘤之間的關(guān)系可概述為免疫編輯的三個(gè)階段：消除、平衡和逃逸［10］。免疫系統(tǒng)能夠檢測并消除新出現(xiàn)的惡性細(xì)胞，防止它們不受控制地?cái)U(kuò)散。癌癥免疫監(jiān)視是重要的宿主保護(hù)方式，可抑制細(xì)胞癌變以及維持正常細(xì)胞處于穩(wěn)定的狀態(tài)。惡性腫瘤細(xì)胞可通過以下的機(jī)制逃避免疫監(jiān)視：（1）免疫識別降低（包括腫瘤抗原表達(dá)水平降低和MHC、共刺激分子表達(dá)的喪失）；（2）通過STAT-3 信號傳導(dǎo)增加腫瘤細(xì)胞對凋亡的抗性；（3）細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子、TGF-β、白介素-10 的分泌和免疫調(diào)節(jié)分子如PD-1/PD-L1、TIM-3、LAG-3 的表達(dá)增加，均導(dǎo)致了惡性腫瘤的進(jìn)展［11］。在腫瘤微環(huán)境中的樹突狀細(xì)胞功能受到明顯的抑制。HILLY［12］證實(shí)位于腫瘤周圍微環(huán)境和腫瘤瘤體內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞和淋巴細(xì)胞處于一個(gè)低表達(dá)的水平，與此同時(shí)在OSCC 中的樹突狀細(xì)胞占比明顯低（11.7/HPF vs.25.0/HPF）。

樹突狀細(xì)胞與細(xì)胞的惡變和惡化有著密切的聯(lián)系，樹突狀細(xì)胞在調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫以及抗腫瘤免疫中扮演了重要角色［13］。在頭頸部鱗癌（HNSCC）以及其他系統(tǒng)腫瘤中，樹突狀細(xì)胞的免疫能力同樣受到不同程度的抑制。不同于MHC-Ⅰ類分子和MHC-Ⅱ類分子，CD1a 也是一種抗原遞呈分子，主要在抗原遞呈細(xì)胞（APC）表面表達(dá)［14］。腫瘤周圍CD1a+標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞耗竭是一個(gè)獨(dú)立影響預(yù)后的因素，預(yù)示著更差的生存結(jié)果和更高的復(fù)發(fā)率［15］。在OSCC腫瘤間質(zhì)中檢測到高水平漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC），但在對照組正常的口腔粘膜中卻很少或未檢測到pDC。機(jī)體帶瘤狀態(tài)下IFN-α、IL-6 和TNF-α等免疫因子分泌減少，造成pDC的數(shù)量減少和功能受損，從而導(dǎo)致更高的機(jī)率發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及總生存率的顯著降低［16］。OSCC 患者癌組織中腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞的密度、MHC-Ⅱ陽性以及CD54 陽性的細(xì)胞比例均降低，腫瘤直徑越大、腫瘤分期越靠后，腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞的表達(dá)水平越低［17-18］。

3 樹突狀細(xì)胞疫苗在治療OSCC 過程中的探索

在樹突狀疫苗的初步探索階段，單次注射抗原脈沖DC 的制備疫苗足以在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)。樹突狀細(xì)胞疫苗治療OSCC 最早由WANG［19］用Tca8113 細(xì)胞裂解物刺激人類外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)出的樹突狀細(xì)胞，激活自體的T 細(xì)胞，在體外進(jìn)行MTT 分析結(jié)果顯示其對腫瘤細(xì)胞殺傷作用有效，并向荷瘤裸鼠給藥，發(fā)現(xiàn)推遲了裸鼠體內(nèi)瘤體的倍增時(shí)間（P＜0.01），即在體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的生長均受到了有效地抑制（P＜0.05）。國內(nèi)最早有報(bào)道將外周血中提取的單核細(xì)胞，以免疫因子誘導(dǎo)成為成熟的樹突狀細(xì)胞，并接受腫瘤裂解物脈沖刺激，再與T 淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)來誘導(dǎo)出特異性細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTL）。相比對照組，腫瘤細(xì)胞裂解物脈沖刺激DCs 能更有效地抑制腫瘤生長及延長腫瘤倍增時(shí)間（P＜0.05）［20］。

以往樹突狀細(xì)胞疫苗的制備通常采用自體外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化成樹突狀細(xì)胞與單一的特異性抗原肽或者腫瘤裂解產(chǎn)物進(jìn)行共培養(yǎng)的方法，這種方法制備的疫苗免疫原性較低，為了提高樹突狀細(xì)胞攝取處理抗原的能力，GAO［21］實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用納秒脈沖電場（nsPEF）技術(shù)，采用適當(dāng)電場強(qiáng)度能增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞對腫瘤抗原的攝取與遞呈能力，并且激活了更多的效應(yīng)細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞在腫瘤的免疫治療中具備天然的優(yōu)勢，WHITESIDE［22］用自體腫瘤凋亡抗原負(fù)載制備樹突狀疫苗，用于Ⅲ/Ⅳ期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者，接種疫苗的患者長期無病生存率得到明顯提高，表明該疫苗有免疫原性且具備一定的安全性。DC 的直接瘤內(nèi)給藥并結(jié)合放射治療，不僅可以對直接給藥的局部腫瘤產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤作用，通過激活GRP94/gp96 途徑，還可以對未治療的遠(yuǎn)處腫瘤產(chǎn)生一定的抗腫瘤作用，即出現(xiàn)抗腫瘤的異位效應(yīng)。但是皮內(nèi)給藥途徑顯示，DC 向淋巴結(jié)的遷移率降低，經(jīng)超聲引導(dǎo)的DC 疫苗接種又可能存在將疫苗注射到脂肪區(qū)域（瘤體外）的弊端［23］，所以影像醫(yī)生輔助疫苗接種將是一個(gè)很好的選擇。當(dāng)受到宿主免疫系統(tǒng)攻擊時(shí)，腫瘤相關(guān)抗原可通過泛素化途徑在蛋白酶體中降解短壽蛋白（包括DRiPs），維持腫瘤細(xì)胞長期穩(wěn)定生存的狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞通過MHC-I 類分子遞呈的抗原多來自于自身降解的DRiPs（有缺陷的核糖體產(chǎn)物）。有研究用自噬誘導(dǎo)劑、蛋白酶體抑制劑、溶酶體抑制劑等處理OSCC細(xì)胞，誘導(dǎo)分離出大量自噬性抗原Dribbles（包含大量DRiPs 的泡狀自噬體），并用其負(fù)載DC，抗腫瘤效果要顯著優(yōu)于腫瘤裂解產(chǎn)物脈沖刺激所制備的疫苗［24］。外泌體是一種納米級的細(xì)胞外小囊泡（30 ～150 nm），包含復(fù)雜的RNA 和蛋白質(zhì)以及其他代謝物組分，廣泛應(yīng)用于機(jī)體的免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲、體液調(diào)節(jié)等，被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)［25］。樹突狀細(xì)胞外泌體同樣具有抗原提呈和激活CD8+T 細(xì)胞的能力［26］。戴欣悅［27］利用免疫檢查點(diǎn)抑制劑外體偶聯(lián)樹突狀細(xì)胞外泌體疫苗治療黑色素瘤，相比對照組抑制了原發(fā)癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并減弱了靶外效應(yīng)，促進(jìn)了免疫檢查點(diǎn)抑制劑的穩(wěn)定。樹突狀細(xì)胞表面高表達(dá)甘露糖受體，殼聚糖-硬脂酸（stearic acid-grafted chitosan，CtSa）是一種糖脂嫁接后得到的產(chǎn)物，將甘露糖嫁接到CtSa可以得到MCt-SA（mannose modified stearic acid-grafted chitosan）。MCtSA 是一種較強(qiáng)的免疫佐劑，在模擬抗原捕獲試驗(yàn)中有出色的表現(xiàn)。體外細(xì)胞攝取試驗(yàn)證實(shí)［28］，甘露糖的靶向修飾后可促進(jìn)DC 對MCtSA 的攝取，以此制備糖脂鈉米疫苗，提高了MHC-I 分子抗原呈遞能力，同時(shí)也增強(qiáng)了抗腫瘤效應(yīng)。

4 樹突狀細(xì)胞疫苗治療過程中存在的瓶頸以及新的嘗試

當(dāng)機(jī)體長期遭受腫瘤侵襲，機(jī)體免疫環(huán)境發(fā)生變化，免疫系統(tǒng)處于被抑制的狀態(tài)，樹突狀細(xì)胞的免疫能力相應(yīng)出現(xiàn)下降，從而發(fā)生腫瘤細(xì)胞免疫逃逸現(xiàn)象。樹突狀細(xì)胞疫苗在體內(nèi)外抗腫瘤的成果是有目共睹的，例如該疫苗在體外能有效地殺傷腫瘤細(xì)胞、使接種腫瘤裸鼠瘤體的倍增時(shí)間延長等。但當(dāng)樹突狀細(xì)胞制備的疫苗接種到患者體內(nèi)時(shí)，由于樹突狀細(xì)胞疫苗本身具有免疫原性容易激活自身免疫反應(yīng)，從而使得疫苗未能達(dá)到預(yù)期的治療效果［29］。

許多研究者為了使樹突狀細(xì)胞疫苗能更準(zhǔn)確的在患者腫瘤部位發(fā)生效力，通過研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)靶腫瘤瘤體內(nèi)高表達(dá)蛋白是一種可靠的方法。HARDWICK 等［30］發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗癌患者腫瘤細(xì)胞中存在P53 肽的蓄積，該試驗(yàn)使用P53 蛋白標(biāo)靶樹突狀疫苗，證實(shí)了被標(biāo)靶的疫苗可在體內(nèi)有效地遷移。由此設(shè)計(jì)的Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)，在16 例患者中有11 例（69%）患者接種P53 肽標(biāo)靶的疫苗后，體內(nèi)特異性T 細(xì)胞的數(shù)量和IFN-g 的分泌量增加以及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）的水平持續(xù)下降，而調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞通常被認(rèn)為可能會阻斷抗腫瘤反應(yīng)。但是該實(shí)驗(yàn)的樣本量很少，需要開展大樣本量的Ⅱ-Ⅳ期隨機(jī)臨床實(shí)驗(yàn)，尋找腫瘤周圍異常蓄積的肽或其他可以穩(wěn)定結(jié)合的基團(tuán)，可能會使得疫苗更有效地遷移。腫瘤靶點(diǎn)的研究依舊是當(dāng)下抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)話題，表皮生長因子受體的過表達(dá)在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌以及其他系統(tǒng)腫瘤中很常見。利用重組純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）-EGFR 融合蛋白［31］，脈沖處理小鼠的樹突狀細(xì)胞制備成疫苗，并評估該種方法制備的疫苗引起的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)、干擾素分泌水平、腫瘤生長速度和小鼠存活率等，相比對照組，實(shí)驗(yàn)組接種GST-EGFR融合蛋白脈沖DC疫苗的小鼠在體外和體內(nèi)均顯示出了明顯的抗腫瘤效應(yīng)（P＜0.05）。有研究指出卵泡抑素樣蛋白-1（FSTL-1）在許多腫瘤中可觀測其過高或過低表達(dá)，F(xiàn)STL-1 可通過改變核因子kb 和Jun-N 末端激酶的表達(dá)從而提高鼻咽癌患者樹突狀細(xì)胞的免疫效力［32］，但需要相關(guān)研究證實(shí)OSCC患者中該蛋白的表達(dá)水平或相關(guān)信號通路及調(diào)控環(huán)節(jié)。

5 小結(jié)與展望

提高樹突狀細(xì)胞疫苗有效遷移能力的同時(shí)仍需提高樹突狀細(xì)胞本身的免疫能力，二者結(jié)合可能會提高樹突狀細(xì)胞疫苗的效力，逆轉(zhuǎn)其在體內(nèi)免疫抑制的狀態(tài)。目前學(xué)術(shù)研究在了解基因組和免疫關(guān)系方面取得了一些進(jìn)展，但迄今為止臨床上有用的生物標(biāo)記物很少，并且需要系統(tǒng)評估腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性、免疫微環(huán)境的變化以及宿主的個(gè)體因素［33］，對疫苗的改進(jìn)帶來巨大的挑戰(zhàn)。很多免疫、腫瘤學(xué)家將腫瘤的免疫治療視為“失敗的假設(shè)”，對免疫系統(tǒng)和網(wǎng)狀樹突狀細(xì)胞系統(tǒng)認(rèn)知不夠全面系統(tǒng)深入依舊是當(dāng)前主要問題。如能發(fā)現(xiàn)更有效的免疫因子佐劑來提高樹突狀細(xì)胞的攝取處理遞呈抗原能力，或刺激分泌下游的免疫因子，從而調(diào)控整個(gè)免疫應(yīng)答過程；找尋并標(biāo)靶更有效生物標(biāo)記物，或篩選基因片段重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，從而改變疫苗遷移的生物行為；使用外泌體作為疫苗的載體并聯(lián)合使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑等，為改進(jìn)疫苗提供了不同的視角。隨著人們對免疫系統(tǒng)的深入認(rèn)識以及對樹突狀細(xì)胞亞群特性方面的掌握，相信未來樹突狀細(xì)胞疫苗會在口腔腫瘤的臨床治療中更為廣泛地受到應(yīng)用并為患者帶來新的希望。