西方許旺酵母及其工業(yè)應(yīng)用概述

孟 秋，章亭洲

（浙江科峰生物技術(shù)有限公司，浙江 海寧 314400）

1909年，Kloecker在西印度群島的圣托馬斯島首次分離到一類子囊孢子酵母，并將其命名為西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）。隨后Schw castellii、Schw alluvius和Schw persoonii也逐漸被分離出來，雖然他們的發(fā)酵特性和西方許旺酵母有較明顯的區(qū)別，但C. W. Price 等基于DNA 重組試驗(yàn)分析將以上四種菌統(tǒng)一命名為Schw occiden?talis。 其 中Schwo ccidentalis、Schw castellii和Schwalluvius的序列同源性超過97%，稱為西方許旺酵母西方變種（Schw occidentalis var. occidenta?lis）；而Schwpersoonii與Schwoccidentalis的序列同源性僅有80%左右，稱為西方許旺酵母皮爾松變種（Schw occidentalis var.persoonii）[1]。

許旺酵母屬（Schw anniomyces）是酵母科內(nèi)孢子目的一個(gè)成員，它同被廣泛研究的酵母屬、克魯維酵母屬和漢森酵母屬一樣，均屬于酵母亞科[2]。西方許旺酵母最引人注意的特征之一在于它可以分泌α-淀粉酶和糖化酶，對(duì)淀粉進(jìn)行高效降解，這也是西方許旺酵母在工業(yè)生產(chǎn)中的重要應(yīng)用之一。

1 西方許旺酵母生理生化特征

1.1 形態(tài)特征

在YM 固體培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)3 d 后，西方許旺酵母細(xì)胞呈圓形及卵圓形，細(xì)胞大小為3～8 μm×3～10 μm；菌落為圓形、凸起、乳白色；可形成假菌絲，產(chǎn)生1個(gè)長彎曲形子囊孢子，這也是它有別于其他子囊菌孢子的一個(gè)重要特征[2]。

1.2 代謝特征

西方許旺酵母能夠利用多種有機(jī)化合物作為碳源，如葡萄糖、果糖、半乳糖、D-木糖（后兩者不能被皮爾松變種同化吸收）、蔗糖、棉籽糖、纖維二糖、海藻糖、乳糖（某些菌株）、琥珀酸酯、檸檬酸酯、乙醇、正構(gòu)烷烴（皮爾松變種除外）、麥芽糖、異麥芽糖、糊精以及可溶或者原淀粉等。需要注意的一點(diǎn)是，蜜二糖并不能被該屬細(xì)菌利用，也不能在不含維生素的培養(yǎng)基上生長，且無硝酸鹽呼吸能力[3-4]。植酸酶能夠?qū)⒓〈剂姿狨マD(zhuǎn)化成無機(jī)磷酸鹽和肌醇單-五磷酸鹽，目前認(rèn)為，西方許旺酵母中植酸酶活性在所有酵母菌中是最高的，且該屬菌株能夠以肌醇六磷酸酯為唯一磷酸來源進(jìn)行生長[5]。

西方許旺酵母的呼吸作用不受高糖濃度的抑制，并且在有氧條件下幾乎不會(huì)進(jìn)行發(fā)酵[6-7]。這也說明它沒有明顯的葡萄糖效應(yīng)，并表現(xiàn)出較強(qiáng)烈的巴斯德效應(yīng)。C.Poinsot等[8]分離出一株細(xì)胞色素b合成缺陷的許旺酵母，與出發(fā)菌株不同的是，該菌株表現(xiàn)出明顯的葡萄糖效應(yīng)，且巴斯德效應(yīng)降低，表現(xiàn)為在相同的有氧條件下發(fā)酵速度顯著增強(qiáng)。表明西方許旺酵母呼吸替補(bǔ)通路的存在。

1.3 生命周期

西方許旺酵母細(xì)胞呈卵形（3.5～8.0 μm×4.5～9.0 μm），無性繁殖方式為出芽繁殖，假菌絲體呈不規(guī)則形態(tài)[9]。細(xì)胞一般以單倍體形式存在。許旺酵母屬細(xì)胞間不能發(fā)生基因融合重組，但母細(xì)胞和子細(xì)胞在形成子囊孢子前可發(fā)生融合。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，母細(xì)胞與子細(xì)胞融合后，首先被細(xì)胞壁分隔開，進(jìn)而進(jìn)行核融合，并進(jìn)一步在母細(xì)胞中發(fā)生減數(shù)分裂。融合后的母細(xì)胞會(huì)在融合部位的細(xì)胞壁上出現(xiàn)一個(gè)黑色的環(huán)，有時(shí)也可以通過細(xì)胞壁接觸區(qū)域的殘留來加以區(qū)分。許旺酵母通過形成一個(gè)或兩個(gè)核桃狀的子囊孢子進(jìn)行有性繁殖，它們一般為寬而平的長突起。也有研究表示，皮爾松變種形成的赤道環(huán)和突起可能與其他許旺酵母有所區(qū)別[10]。從許旺酵母整個(gè)生命周期來看，二倍體的出現(xiàn)是核融合的結(jié)果，此時(shí)的細(xì)胞更利于在不良條件下生存[11]。

2 西方許旺酵母培養(yǎng)基的選擇

西方許旺酵母與釀酒酵母的完全培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）和基本培養(yǎng)基（SD 培養(yǎng)基，以葡萄糖為碳源）相同。其中YPD 培養(yǎng)基組分為1%的酵母膏、2%蛋白胨和2%的葡萄糖。西方許旺酵母的最小基本培養(yǎng)基需含有酵母基礎(chǔ)氮源以及所需氨基酸和碳源，可將其溶解于0.2 mol·L-1Na2PO4（pH 值為6.3）的緩沖液中，以維持淀粉酶的活性。

不同培養(yǎng)基對(duì)酵母孢子形成的誘導(dǎo)效率不同。用酵母提取物或葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基室溫培養(yǎng)5 d后，可誘導(dǎo)西方許旺酵母孢子形成。A. P. James等[12]配制含有1.3%的酵母提取物、0.5%的蛋白胨和1.5%的葡萄糖培養(yǎng)基，pH 值調(diào)整為4.5，9 ℃下培養(yǎng)20 d后觀察到酵母孢子形成。酵母麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基上也可產(chǎn)芽孢[11]。

3 西方許旺酵母的原生質(zhì)體融合

J.J.Wilson 等[13]通過聚乙二醇誘導(dǎo)營養(yǎng)缺陷型突變體的原生質(zhì)體融合，從而產(chǎn)生重組菌株。有些重組子是不穩(wěn)定的異核體，有些重組子是穩(wěn)定的二倍體（或非整倍體），它們可以和新的營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)生有絲分裂。通過添加對(duì)氟苯丙氨酸可以增加有絲分裂頻率。減數(shù)分裂不會(huì)改變雜交種的倍性，因此原生質(zhì)體融合是構(gòu)建許旺酵母多倍體菌株的有效方法，并可用于互補(bǔ)試驗(yàn)中突變體的特性描述，甚至用于減數(shù)分裂的遺傳特征分析。然而，原生質(zhì)體融合似乎并不能產(chǎn)生具有新標(biāo)記的單倍體重組子[13-14]。

西方許旺酵母細(xì)胞的原生質(zhì)體可以在溶胞酶、解旋酶、蝸牛酶、β-葡萄糖醛酸酶或非水溶性葡聚糖酶的作用下產(chǎn)生[12-16]。

西方許旺酵母的轉(zhuǎn)化方法和其他酵母菌（如釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酵母和漢遜酵母）相同[17]。此外，許旺酵母還可進(jìn)行電轉(zhuǎn)化以及醋酸鋰介導(dǎo)的酵母細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化[18-19]。

4 西方許旺酵母的淀粉分解系統(tǒng)

α-淀粉酶可水解淀粉分子的α-1，4 糖苷鍵。研究表明，西方許旺酵母分泌的α-淀粉酶同時(shí)具有α-1，6 糖苷鍵水解活力，可在與糖化酶的協(xié)同作用下快速降解淀粉[14，20-21]。

通過構(gòu)建許旺酵母α-淀粉酶基因缺失突變株（ΔGAM1），發(fā)現(xiàn)其仍然能夠在含有淀粉或以支鏈淀粉作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，盡管生長狀況和淀粉水解能力顯著降低。這一現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是許旺酵母胞內(nèi)存在其他活性較低的淀粉水解酶。盡管如此，GAM1顯然是發(fā)揮淀粉酶活性的主要功能酶[22]。

α-淀粉酶基因的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。西方許旺酵母中α-淀粉酶編碼基因AMYl、SWA2 以及GAMl 基因都會(huì)受到葡萄糖抑制[23-24]。在葡萄糖匱乏時(shí)，α-淀粉酶和糖化酶的表達(dá)受麥芽糖、可溶性淀粉和棉籽糖等的誘導(dǎo)，且對(duì)溫度高度敏感（37 ℃時(shí)被抑制）[25-26]。當(dāng)pH值低于3.5或溫度高于55 ℃時(shí)，西方許旺酵母中的α-淀粉酶和糖化酶均會(huì)失活，60 ℃以上時(shí)該酶被不可逆抑制。

由于在厭氧條件下糖化酶和α-淀粉酶的表達(dá)受到抑制，許旺酵母不能在麥芽糖和淀粉培養(yǎng)基中進(jìn)行代謝，因此表現(xiàn)出明顯的克拉布特里效應(yīng)[27-30]。雖然西方許旺酵母可表達(dá)麥芽糖滲透酶和α-葡萄糖苷酶，但在待測(cè)菌株中淀粉酶活性似乎是影響麥芽糖利用率的限速酶。葡萄糖是淀粉酶的產(chǎn)物之一，同時(shí)也是其表達(dá)的抑制物。這一反饋調(diào)節(jié)作用也解釋了生長穩(wěn)定期該酶表達(dá)活性較高的原因[25,31]。靜止期時(shí)，底物水解產(chǎn)生的葡萄糖不足以達(dá)到抑制濃度，葡萄糖淀粉酶的表達(dá)可以不受抑制地進(jìn)行；在含有2%可溶性淀粉的培養(yǎng)基中，通過增加淀粉酶編碼基因GAM1的拷貝，使培養(yǎng)基中葡萄糖濃度迅速增加，這將對(duì)GAM1造成反饋抑制，直到葡萄糖濃度降到足夠低的水平，從而進(jìn)行新一輪的誘導(dǎo)表達(dá)。

5 西方許旺酵母的工業(yè)用途

5.1 在工業(yè)乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用

在工業(yè)乙醇的生產(chǎn)中，玉米等淀粉原料經(jīng)研磨、“糊化”和“液化”作用，繼而在α-淀粉酶和糖化酶的作用下進(jìn)行“糖化”?！疤腔碑a(chǎn)生的糖類物質(zhì)進(jìn)一步通過釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。在釀造啤酒或生產(chǎn)麥芽威士忌等的過程中，由于一些不可發(fā)酵的麥芽糊精的存在，使得淀粉的糖化效率低。為了降低產(chǎn)品中糊精的含量，通常引入西方許旺酵母來提高糖化效率。一方面，可以通過外源添加西方許旺酵母來源的高效降解酶[32]；另一方面，將西方許旺酵母來源的淀粉高效降解基因在釀酒酵母中進(jìn)行異源表達(dá)。在釀酒酵母中異源表達(dá)西方許旺酵母的α-淀粉酶和糖化酶，已經(jīng)基本實(shí)現(xiàn)了淀粉的完全水解[33-34]。

5.2 在煙草增香提質(zhì)方面的應(yīng)用

煙草中的類胡蘿卜素是煙草香氣成分的重要前體物質(zhì)。類胡蘿卜素在進(jìn)行氧化降解時(shí)，由于雙鍵斷裂的位置不同可形成不同的產(chǎn)物，并進(jìn)一步產(chǎn)生不同的香味物質(zhì)。西方許旺酵母可以降解類胡蘿卜素，生成β-紫羅蘭酮、β-環(huán)檸檬醛、2,2,6-三甲基環(huán)己酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯等香味物質(zhì)[35]。

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)煙草發(fā)酵過程中的微生物進(jìn)行了分離鑒定，發(fā)現(xiàn)煙葉表面分離得到的西方許旺酵母接種量影響煙葉復(fù)烤后香氣組成[36]。鄭堅(jiān)強(qiáng)等[37]通過分析西方許旺酵母雙加氧酶的添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)煙草增香效果的影響，確定了實(shí)驗(yàn)室條件下利用西方許旺酵母進(jìn)行煙葉增香的最佳條件。

5.3 在油脂生產(chǎn)方面的應(yīng)用

伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)微生物產(chǎn)油的研究越來越多。產(chǎn)油微生物能夠以脂質(zhì)形式積累油脂達(dá)其自身總生物量的20%（w/w）以上，是工業(yè)化油脂生產(chǎn)的重要載體[38]。西方許旺酵母是產(chǎn)油酵母的一種，能夠利用廣譜糖類（C5 和C6）進(jìn)行產(chǎn)油發(fā)酵，并能夠產(chǎn)生高達(dá)其總生物量42%的脂肪酸[39]。為了得到酵母胞內(nèi)生產(chǎn)的油脂，可以采用化學(xué)或物理的方法破壞細(xì)胞壁，然而這些方法往往造成油脂提取效率低以及副產(chǎn)物易受到破壞。目前R.Heshof等[40]發(fā)明了一種有效的溫和酶解方法來破壞細(xì)胞，以促進(jìn)從西方許旺酵母中提取脂質(zhì)。

含脂質(zhì)的多不飽和脂肪酸具有良好的營養(yǎng)價(jià)值，有利于健康，并與減少動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥和致癌作用相關(guān)聯(lián)。人類和其他高等動(dòng)物無法合成某些多不飽和脂肪酸，例如亞油酸，它們依賴于日常中攝取的飲食（如豆油和亞麻籽油）來獲取。D.Lamers 等[41]通過過表達(dá)Δ12-去飽和酶，大大提高了西方許旺酵母中多不飽和脂肪酸含量，尤其是亞油酸的產(chǎn)量.

6 總 結(jié)

西方許旺酵母具有不同于釀酒酵母等的生理生化特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。其中，西方許旺酵母分泌的α-淀粉酶不僅具有α-1,4 糖苷鍵水解活力，還可部分代替糖化酶的功能，使淀粉得到高效水解。淀粉的原材料來源廣泛且價(jià)格低廉，在工業(yè)生產(chǎn)中可替代價(jià)格較為昂貴的糖蜜。西方許旺酵母高效水解淀粉的能力也使其用作飼料酵母單細(xì)胞蛋白，作為優(yōu)質(zhì)蛋白源部分或全部替代魚粉和肉骨粉等。此外，西方許旺酵母在煙草增香和油脂生產(chǎn)方面也具有巨大潛力。伴隨著微生物在工業(yè)生產(chǎn)方面的研究發(fā)展，西方許旺酵母必將具有更加廣闊的應(yīng)用空間。