多囊蛋白2對細(xì)胞鈣離子信號調(diào)控的研究進(jìn)展

潘 璠 王愛忠

常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是一種單基因遺傳性腎囊性疾病，可發(fā)生于不同種族人群中。該疾病以腎臟多發(fā)囊腫為特點(diǎn)，患者腎臟呈進(jìn)行性增大，成年后常發(fā)生腎功能衰竭。ADPKD主要由蛋白激酶D(PKD)1或PKD2基因突變引起，PKD1和PKD2突變所致的ADPKD比例分別為85%和15%。Hughes等[1]發(fā)現(xiàn)PKD1編碼的多囊蛋白(polycystin, PC)是一種具有多個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞質(zhì)羧基(C)端的糖蛋白,有超過2 500個氨基酸，其氨基(N)端胞外區(qū)域包含豐富的亮氨酸重復(fù)、1個C型凝集素、16個免疫球蛋白樣重復(fù)和4個Ⅲ型纖維連接蛋白相關(guān)區(qū)域；該結(jié)構(gòu)決定了PC1為一種參與細(xì)胞-細(xì)胞或基質(zhì)-基質(zhì)相互作用的膜蛋白。Mochizuki等[2]發(fā)現(xiàn)PC2是PKD2基因編碼的產(chǎn)物，含有968個氨基酸序列，有6個跨膜區(qū)、細(xì)胞N端和C端。 PC1、PC2與電壓激活的鈣(鈉)通道家族具有氨基酸序列相似性，且含有潛在的鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PC2可與自身、PC1或其他蛋白質(zhì)和配體結(jié)合，作為共同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一部分。Koulen等[3]通過單通道研究進(jìn)一步證實(shí)，在體內(nèi)PC2作為鈣激活的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放通道發(fā)揮作用，細(xì)胞內(nèi)局部鈣濃度的微小變化可能足以激活附近的PC2通道。這種細(xì)胞內(nèi)鈣信號通道的丟失導(dǎo)致了與ADPKD相關(guān)的缺陷。在非腎臟組織中，如血管平滑肌、骨骼肌、心肌細(xì)胞和神經(jīng)元的上皮細(xì)胞也表達(dá)PC1和PC2這兩種蛋白質(zhì)，在胰腺、肝臟、肺、腸、腦、生殖器官、胎盤和胸腺的上皮結(jié)構(gòu)中尤其顯著[4]。隨著對PC2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能的深入研究，越來越多的學(xué)者認(rèn)為PC2作為一種非選擇性鈣離子(Ca2+)通道，通過對Ca2+信號的調(diào)控，在ADPKD的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)對近年來PC2對Ca2+信號調(diào)控的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 PC2的結(jié)構(gòu)及功能研究

PC2是ADPKD第2種致病基因PKD2編碼的產(chǎn)物，該蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上與瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)通道超家族成員高度同源[5]，其N端和C端均位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在跨膜結(jié)構(gòu)5和6與胞內(nèi)N端和C端結(jié)構(gòu)域之間的胞外環(huán)中有1個孔同源區(qū)域，以及1個假定的肌動蛋白結(jié)合(HAX)結(jié)構(gòu)域。PC2的C末端包含1個螺旋結(jié)構(gòu)域、假設(shè)的磷酸化位點(diǎn)和1個EF手結(jié)構(gòu)域(用于結(jié)合Ca2+)[6]。PC2的N端結(jié)構(gòu)域序列則與初級纖毛定位和形成二聚化結(jié)構(gòu)相關(guān)[7]。4個PC2單體組裝成PC2四聚體形成離子通道結(jié)構(gòu)，其二聚化受3個不同域的調(diào)節(jié)[8]。Shen等[9]在冷凍電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，PC2離子滲透通路在跨膜區(qū)6的選擇性過濾器和細(xì)胞質(zhì)附近受到限制，說明有兩個通道均可調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)導(dǎo)；而其胞外結(jié)構(gòu)域是ADPKD致病突變的重點(diǎn)，參與通道組裝，并與跨膜核發(fā)生相互作用。Grieben等[10]的研究則進(jìn)一步證實(shí)，PC2通道結(jié)構(gòu)頂端為結(jié)合1種新的PC特異性的四角形開口，稱為頂部域(TOP domain),由電壓傳感器樣域(voltage-sensor-like domain ,VSLD)的兩個擴(kuò)展構(gòu)成，其覆蓋了通道的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔或細(xì)胞外表面。當(dāng)PC2在ER內(nèi)時，其位于ER腔內(nèi)，當(dāng)PC2在質(zhì)膜或纖毛內(nèi)時，其位于細(xì)胞外表面；而在腎小管上皮細(xì)胞中，PC2則位于腎小管腔內(nèi)。頂部域折疊在多囊蛋白中是保守的，其包括PC1的同源通道樣區(qū)，并且是ADPKD相關(guān)錯義突變體簇的所在位置。頂部域、濾過孔隙和VSLD之間的廣泛接觸為物理和化學(xué)刺激調(diào)控提供了充分的空間。學(xué)者通過研究PC2結(jié)構(gòu)，更深入地認(rèn)識了該蛋白質(zhì)的功能與疾病調(diào)控機(jī)制。

PC2的功能與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)，但其定位尚存爭議。PC2主要定位于高爾基體前膜特別是ER中，其胞質(zhì)尾端的磷酸化包含ER定位信號。細(xì)胞表面生物素化檢測也表明，在上皮細(xì)胞中單獨(dú)的PC2不會運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面[11]，PC2可與PC1形成通道復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜發(fā)揮胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[4]，或通過第5環(huán)的HAX結(jié)合位點(diǎn)與抗凋亡的HS1相關(guān)蛋白(HAX-1)結(jié)合參與接觸細(xì)胞基質(zhì)[12]。學(xué)者通過研究上皮細(xì)胞過表達(dá)PC2的鈣成像發(fā)現(xiàn)，在ER上，肌醇1，4，5-三磷酸(InsP3)刺激表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放信號增強(qiáng)，表明PC2具有Ca2+通道活性。同時，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)局部鈣濃度發(fā)生微小變化時，PC2足以在不與其他蛋白質(zhì)相互作用的情況下激活附近的通道。有研究[13]結(jié)果顯示，PC2而非PC1是原發(fā)纖毛離子通道所需亞基，并且PC2的纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)和離子通道活性與PC1無關(guān)。目前普遍認(rèn)為，PC2還可在質(zhì)膜上起作用，但其活性受ER與質(zhì)膜之間的轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和活化模式等復(fù)雜調(diào)控。有研究結(jié)果表明，質(zhì)膜中PC2的數(shù)量是受到與其相互作用的蛋白質(zhì)[如PC1[14-15]、高爾基體-ER關(guān)聯(lián)蛋白-14(PIGEA-14)[16]和磷酸呋喃酸簇分選蛋白(PACS)[17]]的調(diào)控。PC2還與質(zhì)膜中的其他離子通道亞基[如瞬時受體Ⅰ型電位通道(TRPC1)、瞬時感受器電位蛋白Ⅴ(TRPV4)]相互作用，最終激活細(xì)胞表面表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)[18]。總體來說，PC2可能影響Ca2+從不同的細(xì)胞間室流入，包括纖毛(纖毛質(zhì))、質(zhì)膜和ER，其功能缺失導(dǎo)致Ca2+信號通路失調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和液體分泌相關(guān)的通路異常激活，如cAMP依賴的B-Raf/MEK/ERK級聯(lián)信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和T細(xì)胞活化核因子(NFAT)通路[19]，從而導(dǎo)致腎囊腫的發(fā)生、發(fā)展。

2 PC2在纖毛和質(zhì)膜中對Ca2+信號的調(diào)控

多數(shù)研究已經(jīng)證實(shí)，PC1的卷曲螺旋可與PC2的C端連接形成PC復(fù)合物；如果去除PC1或PC2任何一個的C端，都將破壞這種相互作用。在腎上皮細(xì)胞中,PC2與PC1形成的復(fù)合物主要幫助PC2向質(zhì)膜及初級纖毛的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位，通過傳遞Ca2+信號以響應(yīng)腎小管流體流動的變化而發(fā)揮機(jī)械傳感器功能。PC1或PC2的丟失或功能障礙均可導(dǎo)致細(xì)胞無法感知機(jī)械刺激，從而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和極性的異常，進(jìn)而導(dǎo)致腎囊腫的形成。流體剪切應(yīng)力觸發(fā)的Ca2+信號通過PC2依賴的鈣釋放在初級纖毛中啟動，結(jié)合Ryanodine受體(RyR)，相同的Ca2+信號激活胞質(zhì)鈣反應(yīng)，誘導(dǎo)Ca2+從細(xì)胞內(nèi)流入儲存[20]。PC2也能與TRPC1和TRPV4相互作用。PC2和TRPC1組裝形成與PC1無關(guān)的異源性通道，在G蛋白偶聯(lián)受體(GPR)作用下被激活，并顯示出與單個PC2和TRPC1通道不同的電導(dǎo)模式，無論是通過纖毛彎曲還是通過質(zhì)膜GPR的激活，PC2/TRPC1復(fù)合物的激活都可能影響纖毛相關(guān)Ca2+信號的機(jī)械傳導(dǎo)[21]。PC2也可與TRPV4形成異質(zhì)通道復(fù)合體，利用TRPV4介導(dǎo)機(jī)械性和滲透性信號。在腎衰竭發(fā)生前，PC2/TRPV4復(fù)合體即可介導(dǎo)多囊腎病患者全身滲透壓和血壓調(diào)節(jié)功能的損傷。一項(xiàng)研究[22]顯示，在腎臟集合管纖毛(陽性)細(xì)胞中，表皮生長因子(EGF)通過結(jié)合受體EGFR作用于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，刺激了TRPP2/TRPV4通道的異?；顒?，增加了Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和囊性形成。另一項(xiàng)研究[23]結(jié)果則顯示，纖毛PC2依賴的通道可因去極化和細(xì)胞質(zhì)Ca2+水平升高而激活，這種活性可被瞬時電位受體通道(TRPM)3通道的激動劑(硫酸孕烯醇酮)增強(qiáng)，或被TRPM3通道的特異性抑制劑有效阻斷；在利用CRISPR/Cas9編輯敲除TRPM3基因后，纖毛通道消失，證明PC2可與TRPM3異源結(jié)合發(fā)揮離子通道作用。盡管多數(shù)報道認(rèn)為，在初始纖毛中存在大量Ca2+通道，但Ca2+信號通路在纖毛中作為機(jī)械傳感器的作用仍有爭議。Delling等[24]在研究腎上皮細(xì)胞、腎小管、胚胎結(jié)節(jié)的冠狀細(xì)胞、內(nèi)耳毛細(xì)胞的運(yùn)動神經(jīng)節(jié)和幾種細(xì)胞系的原纖毛血流響應(yīng)時，未在生理或流體的超生理水平發(fā)現(xiàn)特定的Ca2+涌入纖毛。因此，各類Ca2+通道在纖毛上存在的具體作用及機(jī)制需要更深入的研究。

3 PC2在ER中對Ca2+信號的調(diào)控

關(guān)于PC2在ER中的定位也存有爭議。學(xué)者通過對細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的免疫組織化學(xué)檢測和生物素化檢測來確定內(nèi)源性和轉(zhuǎn)染的PC2的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性PC2存在于小鼠腎臟內(nèi)髓集合管(IMCD)細(xì)胞和馬丁達(dá)比犬腎(MDCK)細(xì)胞的質(zhì)膜和原纖毛中，而異源表達(dá)的PC2在ER定位中占主導(dǎo)地位[25-26]。這可能由PC2的C末端存在ER滯留信號，以及對內(nèi)切糖苷酶H的C化作用的高敏感性所致；當(dāng)PC2單獨(dú)表達(dá)時會被滯留在ER膜。ER中的PC2被認(rèn)為是一種Ca2+激活的鈣釋放通道[3]，與其他兩個ER相關(guān)的Ca2+釋放通道，即InsP3受體和RyR一起參與ER內(nèi)Ca2+的調(diào)控[27]。InsP3R是位于ER的Ca2+通道，是一種大相對分子質(zhì)量的(每個亞基314 000)表達(dá)泛素的同聚四聚體。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PC2的C端與InsP3R的N端配體結(jié)合域(LBD)上的一簇帶正電的氨基酸緊密結(jié)合，部分抑制了InsP3與LBD的結(jié)合。PC2與InsP3R之間的相互作用是一種互惠共生關(guān)系，在InsP3刺激ER內(nèi) Ca2+釋放后，這種相互作用建立一個含有高水平Ca2+的信號微域。通過PC2激活Ca2+誘導(dǎo)Ca2+釋放，這種PC2與InsP3R的相互作用有助于解釋為何在PC2 C端截?cái)嗤蛔凅wR742X及點(diǎn)突變體D511V中觀察到的Ca2+瞬變的半衰減時間(t1/2)沒有改變的現(xiàn)象；這是由于PC2 C端尾部的酸性團(tuán)簇的丟失，使PC2與InsP3R的相互作用被破壞，禁止了Ca2+信號微域的形成，從而抑制了激活PC2誘導(dǎo)的Ca2+的釋放。此外，雖然D511V可以與InsP3R發(fā)生物理作用，但PC2通道本身功能的失活可抑制Ca2+通過ER膜[28-30]。另外，InsP3R與PC2的相互作用還與ER中PC1的水平有關(guān)，PC2與基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)競爭結(jié)合InsP3R，高水平PC1可通過增強(qiáng)InsP3R/STIM1的結(jié)合，減少PC2與InsP3R之間的聯(lián)系，從而導(dǎo)致ATP-Ca2+信號的減少[31]；相反地，PC2的突變導(dǎo)致STIM1/InsP3R結(jié)合增多，抑制存儲Ca2+內(nèi)流(store-operated calcium entry, SOCE)。因此，與野生型細(xì)胞相比，TRPP2缺陷型膽管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和ER內(nèi) Ca2+水平和SOCE降低或減少[32]。總體來說，PC2和InsP3R似乎通過干擾正常的Ca2+信號在ADPKD的發(fā)展中發(fā)揮作用。在三維細(xì)胞培養(yǎng)中，被敲除PC2的腎臟細(xì)胞會出現(xiàn)囊腫。而敲除InsP3R 1型和3型也可導(dǎo)致細(xì)胞囊腫的發(fā)生，其特點(diǎn)是體積更大，細(xì)胞死亡增加、進(jìn)一步發(fā)生分化[33]。

RyR是一種位于肌質(zhì)網(wǎng)(SR)/ER的細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放通道，從細(xì)胞內(nèi)存儲釋放Ca2+，激活肌肉收縮和神經(jīng)遞質(zhì)釋放[34]。RyR2是心肌主要的Ca2+釋放通道，與PC2的N端和C端胞質(zhì)區(qū)與RyR2 結(jié)合[35]。有趣的是，在封閉狀態(tài)下，RyR2與PC2末端的130～220氨基酸相互作用，但不與PC2 C末端相互作用；然而，當(dāng)維持在開放狀態(tài)時，RyR2與PC2的N和C 端結(jié)合。PC2 N端似乎對于PC2/RyR關(guān)聯(lián)是必要的，而C端則以Ca2+依賴的方式降低RyR2的開放率[35]。PC2的這種調(diào)節(jié)作用解釋了PKD2缺失小鼠心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+自發(fā)振蕩頻率增加和Ca2+含量減少的現(xiàn)象。斑馬魚和小鼠心肌細(xì)胞的功能研究測試了PC2調(diào)節(jié)RyR2的必要條件，證明PC2功能障礙引起Ca2 +異常傳導(dǎo)，導(dǎo)致心輸出量減少和鈣-收縮偶聯(lián)受損，降低心率和每搏輸出量，縮短心室動作電位，增加房室傳導(dǎo)阻滯的發(fā)生率。PC2對不同血管床的肌源性反應(yīng)有不同的調(diào)節(jié)作用，PC2主要位于人和大鼠大腦動脈平滑肌細(xì)胞膜上，在腸系膜動脈和主動脈則位于ER或SR膜上。在剝離的主動脈環(huán)和腸系膜動脈中，當(dāng)毒胡蘿卜素預(yù)處理使得Ca2+耗盡時，PC2組與對照組大鼠的血管收縮程度無顯著差異。上述結(jié)果表明，在激動劑誘導(dǎo)的血管收縮方面，位于ER膜的PC2可能比位于細(xì)胞膜的PC2更重要。 這也進(jìn)一步解釋了ADPKD患者在疾病后期除了出現(xiàn)腎功能的改變外，還常伴有心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的潛在原因。

4 Ca2+通道作為ADPKD治療靶點(diǎn)的研究

如上所述，Ca2+信號通路的失調(diào)和Ca2+穩(wěn)態(tài)的破壞是ADPKD發(fā)生、發(fā)展的重要原因。因此，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平可作為治療ADPKD的一種有效手段；如雷公藤甲素的臨床前試驗(yàn)已經(jīng)取得了顯著的成果[36]。雷公藤甲素是一種具有活性的二萜化合物，通過PC2機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放。這種分子治療通過恢復(fù)ADPKD模型小鼠Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖抑制了囊腫的擴(kuò)大，改善小鼠腎功能。然而，亦有回顧性研究[37]結(jié)果表明，與未經(jīng)治療的患者相比，使用CCB治療ADPKD患者的腎小球?yàn)V過率降低，從而導(dǎo)致腎功能的進(jìn)一步損傷。此外，鈣化模擬物(如R-568)是鈣敏感受體的變構(gòu)活化劑，用R-568處理PKD2-/WS25ADPKD模型小鼠，對囊腫的發(fā)生無明顯影響[38]；但近期研究[39]發(fā)現(xiàn)，R-568處理PKD1缺陷細(xì)胞可使細(xì)胞線粒體Ca2+水平接近野生型細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，并完全逆轉(zhuǎn)了與PC1通道中斷相關(guān)的細(xì)胞能量的損失。盡管目前依賴于Ca2+通道調(diào)節(jié)劑的治療效果仍有爭議，但相關(guān)研究路徑值得堅(jiān)持，以期發(fā)現(xiàn)更有效的藥物或治療方案。

5 結(jié) 論

Ca2+信號通過參與大量細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)節(jié)廣泛的病理生理學(xué)過程。Ca2+信號在基因表達(dá)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸傳遞、肌肉收縮、代謝、增殖等方面具有重要作用。Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個復(fù)雜的生理學(xué)過程，而PC2作為一種非選擇性的Ca2+釋放通道，其功能的失活將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外Ca2+信號的失控而激發(fā)一系列細(xì)胞功能紊亂，如對細(xì)胞凋亡的敏感性增加[40]，促進(jìn)細(xì)胞增殖從而導(dǎo)致腎囊腫的發(fā)生、發(fā)展。目前，對PC2的功能研究多集中在ADPKD疾病的研究方面，事實(shí)上PC2作為一種普遍存在的應(yīng)激敏感蛋白質(zhì)，其表達(dá)在響應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激時上調(diào)，以防止多種疾病誘導(dǎo)的細(xì)胞病理性死亡[41]。因此，針對PC2在腎臟系統(tǒng)的致病機(jī)制應(yīng)展開更為深入的研究。