慢性間歇性低氧對心肌梗死急性期小鼠C1q腫瘤壞死因子相關蛋白9 的表達及對心功能的影響

李澤萱 杜蕓輝 黃 鑫 李思懿 王 曉 聶紹平

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea，OSA)是一種常見的睡眠呼吸障礙，其特點是睡眠過程中上氣道完全或部分阻塞導致反復呼吸暫停和/或呼吸淺慢。 OSA 引起心血管損害的主要機制是慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)。然而，OSA 對于心肌梗死急性期的心肌損傷是否存在影響目前仍存在爭議。 有研究顯示，在非致命性心肌梗死患者中，OSA 可能通過缺氧預適應誘導心肌形成微血管從而減輕心肌損傷[1-2]。 C1q 腫瘤壞死因子相關蛋白9(CTRP9)是一類與脂聯(lián)素高度同源的脂肪因子[3]。 既往研究顯示，缺血性心肌損傷后血漿CTRP9 水平下降，在CTRP9 水平升高或降低的情況下，心肌梗死的面積可以相應的減小或增大[4]。 本研究通過觀察在CIH 暴露下，小鼠心肌梗死急性期CTRP9 的表達及心功能的變化，以評價OSA 對心肌梗死急性期心肌損傷的作用。

材料與方法

1.研究材料 (1)實驗動物 選取健康SPF 級雄性C57BL/6 WT 小鼠，6 ～8 周齡，體質量(25±3)g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。 實驗動物在首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院實驗動物房內正常飼養(yǎng)，動物房內溫度控制在23 ～26 ℃，相對濕度控制在60%，環(huán)境安靜、通風干燥，晝夜節(jié)律12 h 循環(huán)，動物自由攝取水和無菌飼料，符合實驗動物倫理委員會的要求。

(2)主要實驗試劑 蛋白定量試劑盒、反轉錄試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq II 購于日本TAKARA 公司；GAPDH多克隆抗體購于北京中杉金橋公司；CTRP9 多克隆抗體購于美國Aviscerbabio Science 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購于美國Licor 公司；小鼠血漿的CTRP9 ELISA 試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司；MASSON 三色染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

2.方法 (1)動物分組 按照隨機數字表法將小鼠隨機分為低氧組(CIH， n ＝18) 和常氧組(NOR， n ＝18)。 CIH 組小鼠在低氧艙中飼養(yǎng)28 d后，接受心臟左冠狀動脈前降支結扎手術，術后再次暴露于CIH 環(huán)境3 d(CIH-MI 3 d，n ＝6)、7 d(CIHMI 7 d， n ＝6)和14 d(CIH-MI 14 d，n ＝6)。 NOR 組小鼠于正常環(huán)境中飼養(yǎng)28 d 后，接受心臟左冠狀動脈前降支結扎手術，術后再次于正常環(huán)境中飼養(yǎng)3 d(NOR-MI 3 d，n ＝6)、7 d(NOR-MI 7 d， n ＝6)和14 d(NOR-MI 14 d，n ＝6)。

(2) 干預方法 采用 OxyCycler A84(BioSpherix，USA)動態(tài)編程三氣動物培養(yǎng)箱建立CIH 模型。 將CIH 組小鼠放入培養(yǎng)箱內，由電腦軟件按照設定的氣體濃度-時間曲線使艙內氧氣濃度6%～21%之間循環(huán)。 CIH 組小鼠每天在培養(yǎng)箱內8 h，持續(xù)28 d，艙內溫度、濕度與室內相同。 NOR 組放于常氧環(huán)境中，干預時間與CIH 組相同。

(3)動物模型制備 提前對全部小鼠進行左胸部脫毛處理，使小鼠在3.0%異氟烷吸入麻醉后取仰臥位，頭部和四肢固定于手術臺上，使用呼吸麻醉機維持麻醉狀態(tài)，于胸骨左緣捫及心臟搏動處縱行切開皮膚，然后逐層鈍性分離肋間肌肉，于第四肋間打開胸腔，拇指食指輕微用力將心臟擠出胸腔。 以左心耳下緣為標志，左心耳根部下2 ～3 mm 用6-0無創(chuàng)縫線穿過左冠狀動脈前降支，進針深度0.5 mm，術中可見結扎線以下心肌顏色變白，可初步認為心肌梗死建模成功，即可將心臟送回胸腔內。 最后，用3-0 無創(chuàng)縫線常規(guī)結扎關閉胸腔。 將麻醉狀態(tài)解除后查看小鼠能否自主呼吸。 小鼠術后注意保溫，避免搬動，待其清醒。

表1 各組小鼠心臟多普勒超聲檢測結果的比較

表1 各組小鼠心臟多普勒超聲檢測結果的比較

注:與MI 3 d 組比較，*P＜0.05；與MI 7 d 組比較，＃P＜0.05

NOR項目MI 3 d(n＝6)MI 7 d(n ＝6)MI 14 d(n ＝6)CIH F 值 P 值MI 3 d(n ＝6)MI 7 d(n ＝6)MI 14 d(n ＝6)F 值 P 值LVIDd/mm 3.6 ±0.2 4.0 ±0.7 4.9 ±0.3*＃ 10.721 0.001 3.3 ±0.3 4.4 ±0.2* 5.2 ±0.2*＃ 76.806 0.000 LVIDs /mm 3.4 ±0.3 3.5 ±0.6 4.4 ±0.3*＃ 10.510 0.001 2.6 ±0.3 4.3 ±0.3* 4.9 ±0.3*＃ 90.852 0.000 LVPWd /mm 1.5 ±0.4 1.6 ±0.6 1.8 ±0.5 0.352 0.709 1.3 ±0.4 1.8 ±0.6 2.0 ±0.7* 2.513 0.562 LVPWs /mm 1.7 ±0.4 1.9 ±0.6 2.0 ±0.4* 0.549 0.589 1.4 ±0.4 2.2 ±0.5* 2.2 ±0.9* 3.286 0.605 FS/% 17.1 ±2.7 13.7 ±0.8* 10.4 ±1.6*＃ 19.893 0.000 21.2 ±3.3 14.2 ±1.5* 9.7 ±0.5*＃ 46.478 0.000 LVEF/% 37.3 ±5.3 29.2 ±1.6* 22.8 ±3.3*＃ 22.891 0.000 45.3 ±4.8 30.8 ±3.1* 21.3 ±0.9*＃ 78.459 0.000

圖2 CIH 和NOR 組小鼠冠狀動脈結扎后3 d 的心臟多普勒超聲檢測結果注:與NOR 組比較，*P＜0.05；與NOR 組比較，**P＜0.01

(4) 心臟多普勒超聲檢測 采用實驗動物房VisualSonics Vevo 2100 型超聲儀對小鼠進行心臟多普勒超聲測量。 將小鼠稱重后麻醉左胸前脫毛，固定于操作臺，調整探頭角度以獲得左心室的長軸切面，然后將探頭順時針轉動90°，獲得左心室短軸的各個切面。 數值取測量三個心動周期的平均值。

(5) MASSON 染色 麻醉并固定動物，剪開胸腔，充分暴露心臟，剪開右心耳，用0.9%氯化鈉液經心尖灌流至肝臟組織發(fā)白后，剪下心臟，置4%的多聚甲醛溶液中24 h 固定，包埋后切成厚度約5 μm 的石蠟切片，脫水并進行MASSON 染色。 鏡下可見膠原纖維成分呈藍色，正常心肌呈紅色。

(6) Western blot 法檢測小鼠心肌CTRP9 蛋白表達水平 提取小鼠心肌組織蛋白，冰上裂解，制備心臟組織勻漿，離心后取上清液存于EP 管中。 采用BCA 法測定蛋白濃度，加裂解液保存于-80 ℃冰箱備用。 進行SDS-PAGE 后，將蛋白轉至PVDF 膜上。 用5% BSA 封閉1 h 后，孵育相應一抗4 ℃慢搖過夜，恢復室溫后，TBST 清洗，室溫慢搖1 h 孵育二抗，膠片發(fā)光，并用Image 分析軟件進行各條帶吸光度值計算。 目的蛋白均與GAPDH 蛋白校準。

(7) RT-PCR 法檢測小鼠心肌CTRP9 mRNA 的水平 取各組小鼠心臟，用TRIzol 提取心肌的總RNA，用反轉錄試劑盒將每組2 mg 的總RNA 反轉錄為cDNA。 把反轉錄產物稀釋1 倍，利用熒光定量PCR 儀進行PCR 反應。 每個樣品設3 個復孔。目的基因均與GAPDH 基因的表達進行校準。

(8) ELISA 法檢測小鼠血漿CTRP9 濃度 心臟取材前，用經肝素潤管的注射器在心尖搏動最強處進針，由于心臟跳動使血液泵入注射器，可取約1 mL 血液，并立即在4 ℃下離心，后將血漿冷凍在-80 ℃下進行后續(xù)測定，避免重復凍融循環(huán)。 使用ELISA 試劑盒通過夾心法測定血漿CTRP9 濃度。樣品一式兩份進行測定。

3.統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS 25.0 和GraphPad 7.0 軟件處理。 計量資料均數±標準差表示，比較用非配對t 檢驗；多組之間的比較用多因素方差分析。 計數資料以頻數(率)表示。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.各組小鼠心臟多普勒超聲檢測 結果顯示，在冠狀動脈結扎3、7、14 d 后，CIH 組和NOR 組小鼠的舒張期左心室后壁厚度(LVPWd)和收縮期左心室后壁厚度(LVPWs)均無顯著改變。 兩組小鼠的LVIDd 和LVIDs 均逐漸增加(均P ＜0.001)，LVEF 和短軸縮短分數(FS)均逐漸減少(均P ＜0.001)，提示小鼠左心室擴張、心功能減低(圖1，表1)。 此外，冠狀動脈結扎術后3 d，CIH 組小鼠的LVEF 和FS 均顯著高于NOR 組(均P ＜0.05)，LVIDs 明顯低于NOR 組(P＜0.01)。 LVIDd 和左心室后壁厚度無顯著改變(圖2)。

2.各組小鼠心肌纖維化程度 在冠狀動脈結扎術后3 d，CIH 組小鼠心肌纖維化的面積比例明顯小 于 NOR 組[(0.79 ± 0.0016)% vs.(4.48 ±0.0167)%，P＜0.001，圖3]。

3.各組小鼠心肌組織CTRP9 表達水平 在CIH 組和NOR 組中均可觀察到相較于MI3d 組，MI7d 組CTRP9 的蛋白表達水平均上調(CIH: P＜0.05；NOR: P＜0.01)。 在MI 3 d 時可發(fā)現，CIH 組小鼠心肌組織的CTRP9 蛋白表達水平高于NOR 組(P＜0.05，圖4)。 小鼠心肌組織中CTRP9 mRNA 的表達水平也發(fā)現了同樣的規(guī)律，MI7d 組小鼠的CTRP9 mRNA 水平高于MI3d 組(CIH: P ＜0.05；NOR: P＜0.01)， 可能預示著心肌損傷嚴重程度從心肌梗死后急性期到亞急性期或愈合期的恢復。 此外，在MI 3 d 時CIH 組小鼠心肌組織的CTRP9 mRNA 表達水平也高于NOR 組(P＜0.05，圖5)。

4.各組小鼠血漿CTRP9 濃度 冠狀動脈結扎術后7 d，CIH 組和NOR 組小鼠的血漿中CTRP9 的濃度均高于冠狀動脈結扎術后3 d(CIH: P＜0.05；NOR: P＜0.01)。 在心肌梗死急性期時，CIH 組小鼠的血漿CTRP9 濃度高于NOR 組(P＜0.01)，圖6。

圖3 小鼠冠狀動脈結扎后3 d 的Masson 染色 A:CIH 組，B:NOR 組

圖4 各組小鼠心肌組織中CTRP9 蛋白表達水平 A:各組心臟中GADPH 和CTRP9 的表達水平；B:各組心臟中CTRP9/GADPHA 的量化結果注:與NOR＋MI 3 d 組比較， *P＜0.05；與NOR＋MI 3 d 組比較， **P＜0.01；與CIH＋MI 3 d 組比較，＃P＜0.05

圖5 各組小鼠心肌組織中CTRP9 mRNA 表達水平 注:與NOR＋MI3d 組比較， *P＜0.05；與NOR＋MI 3 d 組比較，**P＜0.01；與CIH＋MI 3 d組比較，＃P＜0.05

圖6 各組小鼠血漿中CTRP9 濃度 注: 與NOR＋MI 3 d 組比較，**P ＜0.01；與CIH＋MI 3 d 組比較，＃P＜0.05

討 論

本研究發(fā)現，與NOR 干預相比，在結扎冠狀動脈前后均進行CIH 干預的小鼠心肌纖維化面積顯著減少、LVEF 明顯提高，主要體現在心肌梗死后3 d。 此外，在心肌梗死急性期，CIH 組小鼠心肌組織和血漿中的CTRP9 水平顯著升高。 本研究提示CTRP9 可能參與CIH 在心肌梗死急性期的保護作用。

OSA 是一種常見的睡眠呼吸障礙，多發(fā)于肥胖人群，并且與心血管疾病密切相關。 一項多中心臨床研究證實，在全球范圍內有約9.36 億成年人患有輕度至重度OSA，其中4.25 億為中度至重度OSA，而中國則是患病率最高的國家[5]，在急性冠狀動脈綜合征患者中的患病率達54%～69%[6]。 OSA 可以通過多種病理生理學因素來參與心血管疾病的發(fā)生，包括CIH、睡眠片段化和胸內壓力波動，從而導致心臟和肺血管血流動力學改變[7]。 大量臨床研究證實，OSA 可引起亞臨床心肌損傷，是遠期心功能不全和死亡的危險因素[8-9]。 但是一些基礎實驗發(fā)現，在心肌梗死急性期缺氧預適應可能對心臟保護產生正面影響，可能與側支循環(huán)的形成、激活心肌細胞自噬或與增強抗氧化酶表達有關[2，10]。 例如，Estrada 等[11]對狗進行了為期20 d 的間歇性低氧訓練后(每天5～8 次，每次持續(xù)5～10 min 中度低氧，4 min 的常氧暴露)，將左冠狀動脈前降支閉塞60 min，然后再灌注5 h。 結果發(fā)現CIH 使心肌梗死面積從(41±5)%急劇降低至(1.8±0.9)%(P ＜0.001)。 類似的，在Béguin 等[12]實驗中，經過CIH預處理的大鼠，在隨后的缺血-再灌注損傷中心肌梗死面積明顯減小。 Chang 等[10]的研究結果表明，于每30 min 氧氣濃度在5%～20%之間循環(huán)的環(huán)境中培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞，可以發(fā)現CIH 可以通過上調抗氧化酶的作用，保護心肌細胞免受H2O2-和缺血-再灌注誘導的氧化應激和細胞死亡。 以上研究表明，短暫暴露于輕度CIH 可以保護心臟免受更嚴重的缺氧和局部缺血的影響，即心臟可以適應短暫的、適當深度的間歇性低氧反應，增強心肌對后續(xù)更嚴重缺血性事件的耐受性，從而發(fā)揮心臟保護作用[13]。 在本研究中，可能由于永久性高位結扎冠狀動脈對小鼠心肌造成的缺血損傷更為嚴重，所以僅在心肌梗死急性期觀察到明顯的缺氧預適應對心功能的改善作用。

CTRP9 屬于脂聯(lián)素旁系同源的CTRP 家族，較脂聯(lián)素在心肌組織中的表達更為顯著，可以參與調控與肥胖相關的代謝紊亂或心血管疾病[14]。 Zhao等[15]在CTRP9 敲除小鼠模型中探索了心源性CTRP9 在心肌損傷中的作用。 小鼠體外模擬缺血/再灌注后，心臟CTRP9 的表達下降，而其過表達則改善了左心功能不全和心肌細胞凋亡。 在非酒精性脂肪肝模型中，CTRP9 通過AMPK 調控自噬抑制內質網應激，減輕了肝脂肪變性，減少細胞凋亡[16]。CTRP9 主要通過促進AMPK 磷酸化抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮心臟保護作用，AMPK 活性的阻斷消除了CTRP9 對心肌細胞凋亡的抑制作用[17]。 本研究發(fā)現，經過CIH 干預的小鼠在心肌梗死的急性期內，心臟保護因子CTRP9 的表達較NOR 組更多。 這可能是由于CIH 組發(fā)生缺氧預適應，使心肌CTRP9 表達增多，通過激活AMPK 依賴的自噬過程，抑制心肌細胞凋亡，減少心肌梗死面積，改善心功能。

綜上所述，CIH 干預在心肌梗死急性期可能發(fā)揮心臟保護作用，表現為梗死面積減少及心功能改善。 CTRP9 可能在CIH 保護心肌損傷中發(fā)揮關鍵作用[18]。 仍需進一步研究CTRP9 參與CIH 改善心肌損傷中的作用機制。