急性ST 段抬高型心肌梗死患者血漿微小核糖核酸-208a 水平對并發(fā)急性心力衰竭的預測價值

楊朋康 董昕

急性心力衰竭(acute heart failure，AHF)是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者最常見的院內(nèi)并發(fā)癥之一，一旦發(fā)生，往往提示患者預后欠佳，嚴重者可導致患者休克或死亡[1-2]。 早期預測AHF，及時采取針對性干預措施，對改善AMI患者預后具有重要臨床意義。 微小RNA(micro RNA，miRNA)是真核生物體內(nèi)廣泛存在的一類長約22nt 的非編碼小RNA。 近年來，大量研究證據(jù)顯示多種miRNAs 可能參與冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭等心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程[3-6]。MiR-208a 即是其中之一，正常人血清中幾乎檢測不到miR-208a 表達，但在AMI 患者血清中表達顯著增加，部分研究甚至認為miR-208a 對AMI 的早期診斷價值高于心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)等傳統(tǒng)血清學指標[7-8]。 此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-208a 可通過上調(diào)肌球蛋白重鏈β(myosin heavy chain beta，β-MHC)，誘發(fā)心肌重構(gòu)，參與心肌纖維化，是預測心源性死亡和心力衰竭的重要因子[9]。本研究擬通過檢測急性STEMI 患者血漿miR-208a表達水平情況，觀察血漿miR-208a 對急性ST 段抬高型心肌梗死(ST-elevated myocardial infarction，STEMI)患者并發(fā)AHF 的預測價值，為臨床提供參考。

資料與方法

1.研究對象 連續(xù)性選擇2018 年1 月至2019年6 月，在西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的急性STEMI 患者152 例納入病例組，包括男性85 例，女性67 例，平均年齡(60.97±12.40)歲。 納入標準:①年齡＞18 歲；②首次發(fā)病，且發(fā)病到入院時間＜12 h；③STEMI 診斷符合2015 年中國急性ST 段抬高型心肌梗死診斷和治療指南[10]，且均經(jīng)冠狀動脈造影證實。 排除標準:①既往診斷冠心病、心肌病、瓣膜病、結(jié)締組織病、心力衰竭等各類心臟疾??；②合并嚴重肝腎功能障礙、各類惡性腫瘤、嚴重感染、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、嚴重腦卒中等；③妊娠期女性。 另采用隨機數(shù)字表法在同期于我院行健康體檢人員中隨機選擇60 例作為對照組，其中男性33 例，女性27 例，平均年齡(59.85±12.28)歲。 經(jīng)西安市第一醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有入組人員充分了解研究內(nèi)容，并簽署知情同意書。

病例組患者入院后48 h 內(nèi)根據(jù)其臨床表現(xiàn)、體格檢查和相關輔助檢查結(jié)果評估是否合并AHF，將病例組分為AHF 亞組和非AHF 亞組。 評估標準參考文獻[11]:①新發(fā)的典型心力衰竭臨床表現(xiàn)(如疲乏、呼吸困難、不能平臥等)；②心率加快，或出現(xiàn)奔馬律，或下1/2 肺野可聞及濕羅音(住院期間心功能Killip II 級或以上)；③胸部影像學檢查顯示存在肺淤血、肺水腫、胸腔積液；④超聲心動檢查提示心功能受損(如LVEF＜0.5 等)；⑤心源性休克。

2.方法 (1) 臨床資料收集:收集所有入組人員的一般臨床資料，包括性別、年齡、BMI、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史、血脂異常病史及再灌注治療情況，動態(tài)檢測BNP、hs-CRP)和cTnI，均取入院24 h 內(nèi)的峰值作為結(jié)果進行統(tǒng)計。

(2) 血漿miR-208a 檢測:病例組患者在入院時采集外周靜脈血，對照組采集清晨空腹靜脈血，1 600 r/min，離心15 min 后使用含EDTA 的離心管留取上清液，再4 ℃條件下15 000 r/min，離心15 min，使用無RNA 酶的凍存管收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?采用普洛麥格(北京)生物技術有限公司的EastepTM總RNA 提取試劑盒提取總RNA，采用實時熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測血漿miR-208a 水平，以U6 為內(nèi)參基因，試劑盒采用Takara 公司的Mir-XTM miRNA qRT—PCR SYBR?試劑盒，miR-208a 特異引物為5′-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU-3′，嚴格按照使用說明書進行。采用2-△△Ct方法計算miR-208a 相對表達水平。

3.統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件分析處理。 對符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗的計量資料結(jié)果以均值±標準差表示，兩組均數(shù)比較用t 檢驗；對于不符合正態(tài)分布或方差齊性檢驗的計量資料結(jié)果采用四分位數(shù)表示，兩組樣本比較采用Mann-Whithey 檢驗。 計數(shù)資料結(jié)果以構(gòu)成百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。 相關性分析采用Pearson 線性相關性分析法。 繪制ROC 曲線評價miR208a 和BNP 對AHF 的預測價值，曲線下面積(area undercurve，AUC)比較采用單因素Z 檢驗。 多因素分析采用二分類Logisitic 回歸分析法。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 病例組和對照組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較[，n(%)，M(QR)]

項目 對照組(n ＝60) 病例組(n ＝152) t/χ2/Z 值 P 值年齡/歲 59.85±12.28 60.97±12.40 0.594 0.560男性 33(55.0) 85(55.9) 0.015 0.903 BMI/(kg/m2) 25.12±4.23 25.39±3.95 0.439 0.666吸煙 24(40.0) 63(41.5) 0.037 0.847高血壓 36(60.0) 99(65.1) 0.490 0.484糖尿病 10(16.2) 20(13.2) 0.436 0.509血脂異常 35(58.3) 104(68.4) 1.939 0.164再灌注治療 — 137(90.1) — —BNP/(ng/L) 172.80(85.20，261.10) 1345.70(945.60，1945.50) 10.608 0.000 Hs-CRP/(mg/L) 4.80(2.50，8.10) 10.50(7.90，13.60) 8.885 0.000 cTnI/(μg/L) 0.53(0.40，0.66) 2.82(1.81，6.17) 8.557 0.000 miR-208a 1.33(1.00，1.67) 26.67(16.00，42.67) 10.919 0.000

表2 AHF 亞組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較[，n(%)，M(QR)]

表2 AHF 亞組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較[，n(%)，M(QR)]

項目 AHF 亞組(n＝86) 非AHF 亞組(n＝66) t/χ2/Z 值 P 值年齡/歲 61.32±11.94 60.50±13.06 0.402 0.692男性 53(61.6) 32(48.5) 2.617 0.106 BMI/(kg/m2) 25.54±4.06 25.18±3.83 0.555 0.586吸煙 39(45.4) 24(36.4) 1.242 0.265高血壓 57(66.3) 42(63.6) 0.115 0.735糖尿病 13(15.1) 7(10.6) 0.665 0.415血脂異常 64(74.4) 40(60.6) 3.297 0.069再灌注治療 73(84.9) 63(95.5) 4.430 0.035 BNP/(ng/L) 1668.20(1056.40，3345.30) 990.80(458.20，1133.60) 6.937 0.000 Hs-CRP/(mg/L) 12.30(8.60，15.30) 9.60(5.70，11.70) 6.606 0.000 cTnI/(μg/L) 4.80(2.84，8.03) 1.62(1.05，3.98) 9.438 0.000 miR-208a 42.67(32.00，64.00) 21.33(13.33，42.67) 9.573 0.000

結(jié) 果

1.兩組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較 病例組與對照組比較在年齡、性別、BMI、吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常等方面，差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)；病例組BNP、hs-CRP、cTnI 血清水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(均P ＜0.05)。 病例組血漿miR-208a 相對表達水平顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＝0.000，表1)。

2.AHF 亞組一般臨床特征和血漿miR-208a 水平比較 AHF 亞組與非AHF 亞組比較，兩組在年齡、性別、BMI、吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常等方面兩組差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)；AHF 亞組再灌注治療比例明顯低于非AHF 亞組，BNP、hsCRP和cTnI 血清水平均顯著高于非AHF 亞組，差異具有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。 AHF 亞組血漿miR-208a 相對表達水平顯著高于非AHF 亞組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P ＝0.000，表2)。

3.病例組血漿miR-208a 相對表達水平與BNP、hsCRP 和cTnI 的相關性分析 Pearson 相關性分析結(jié)果顯示病例組患者血漿miR-208a 相對表達水平與BNP、hsCRP 和cTnI 均呈正相關關系(均P ＜0.001， 表3)。

表3 影響血漿miR-208a 相對表達水平的相關性分析

4.急性STEMI 患者并發(fā)AHF 的危險因素分析以單因素分析P＜0.05 參數(shù)為自變量，包括再灌注治療、BNP、hs-CRP、cTnI 和miR208a，以是否并發(fā)AHF 為因變量，采用二分類Logistic 回歸分析結(jié)果顯示血漿miR-208a 相對表達水平是急性STEMI 患者并發(fā)AHF 的獨立危險因素(OR ＝2.118，95%CI:1.127～3.982，P ＝0.007， 表4)。

5.急性STEMI 并發(fā)AHF 的預測價值分析 繪制血漿miR-208a 和BNP 預測AHF 的ROC 曲線，AUC 分別為0.896(0.844，0.948)和0.879(0.827，0.932)，采用Z 檢驗比較兩者AUC 差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 按照約登指數(shù)最大原則，血漿miR-208a 預測AHF 的cut-off 值為32.00，對應的敏感性和特異性分別為88.4%和83.3%(圖1)。

表4 影響急性STEMI 患者并發(fā)AHF 的Logistic 回歸分析結(jié)果

圖1 預測并發(fā)AHF 的ROC 曲線

討 論

盡早識別AMI 后AHF 發(fā)生，指導臨床醫(yī)生及時進行干預，是改善此類患者預后的關鍵。 目前研究已發(fā)現(xiàn)BNP、hs-CRP、胱抑素C、甲狀腺激素等多種血清學標記物具有一定預測AHF 價值，但普遍存在特異性和(或)敏感性欠佳的問題[12-15]。 如BNP 作為目前臨床廣泛推薦的心力衰竭預測和評估指標，其對AHF的陰性預測值可到達94%～98%，但陽性預測值僅為60%[12]。 此外，BNP 生物半衰期時間僅為20 min，對檢測時間窗有一定限制。 因此，尋找其他可表達穩(wěn)定，檢測方便，且預測AHF 特異性和敏感性俱佳的生物學標志物具有重要臨床意義。

MiRNAs 是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)的非編碼小RNA，一般長約22nt。 大量研究證據(jù)證實miRNAs 在多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展進程中起到至關重要作用[16]。 近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 與冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭、高血壓、心肌肥大等心臟疾病的發(fā)生發(fā)展也密切相關[3-6]。 如miR-181、miR-126、miR-155 等可通過抑制/激活趨化因子參與動脈粥樣硬化形成過程[17]；外周血miR-499用于診斷AMI 的AUC 可達0.86，診斷敏感性和特異性均高于90%[18]；miR-106b-5p、miR27a-3p 和miR8b-5p 可能參與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)調(diào)節(jié)，與高血壓發(fā)病密切相關[19]。

MiR-208a 是目前心血管病領域關注較多的miRNAs 種類之一，幾乎僅在心臟中表達，在心肌損傷時表達升高。 多個動物及臨床研究表明，外周血中miR-208a 水平在心肌壞死后1 h 即可出現(xiàn)特異性升高，3 h 達到峰值[7，20]。 Xu 等[21]使用異丙腎上腺素誘導構(gòu)建大鼠心肌缺血動物模型，并檢測大鼠心肌缺血后不同時段血漿miR-208a 與cTnI 水平，發(fā)現(xiàn)兩者在梗死后6 h 內(nèi)變化趨勢相似，6 h 后miR-208a 呈下降趨勢，而cTnI 繼續(xù)升高。 Wang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-208a 對心肌梗死具有較高的診斷價值，ROC 曲線結(jié)果AUC 可高達0.965，且在心肌梗死發(fā)病4 h 內(nèi)，部分患者外周血檢測肌鈣蛋白未達到診斷閾值時即能夠檢測到miR-208a 明顯升高。 Han等[22]研究發(fā)現(xiàn)AMI 患者血漿miR-208a 表達水平與心肌損傷程度密切相關。 此外，也有研究對miR-208a 診斷AMI 持否定意見，如D′Alessandra 等[23]檢測9 例ST 段抬高型心肌梗死患者miR-208a 血清表達水平，結(jié)果顯示其中6 例患者未檢測出miR-208a，另外3 例患者miR-208a 表達水平很低。 考慮AMI 患者血清miR-208a 檢測有一定時間窗，各研究結(jié)論不一致可能與之相關。 本研究結(jié)果顯示病例組患者血漿miR-208a 相對表達水平顯著高于健康對照組，且急性STEMI 患者血漿miR-208a 相對表達水平與外周血BNP、cTnI 和hs-CRP 均呈正相關關系，再次表明血漿miR-208a 表達水平可反應AMI患者即時心肌損傷狀態(tài)，可能對AHF 發(fā)生具有潛在的預測價值。

目前，研究證實miR-208a 是由α-心肌肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain，α-MHC)基因(Myh6)29 號內(nèi)含子編碼，可上調(diào)β-心肌肌球蛋白重鏈(βmyosin heavy chain，β-MHC)[9]。 Callis 等[24]構(gòu)建miR-208a 轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)miR-208a 高表達能誘導肥厚心肌細胞中β-MHC 表達增加。 相反，敲除miR-208a 可導致成年小鼠β-MHC 表達減少[25]。眾所周知，心臟收縮功能取決于兩種肌球蛋白重鏈亞型α-MHC 和β-MHC 的比例，二者相對表達比例發(fā)生變化將導致心肌肥大和纖維化。 一般研究認為，β-MHC 表達增加是心肌肥厚和心衰的重要標志。 因此，對于AMI 患者并發(fā)AHF，除了與心肌梗死后即刻的心肌損傷有關，可能也與AMI 后心肌miR-208a 表達上調(diào)，β-MHC 表達增多有關。 本研究進一步比較AHF 亞組和非AHF 亞組血漿miR-208a表達水平，結(jié)果顯示AHF 亞組顯著高于非AHF 亞組，多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，血漿miR-208a 是急性STEMI 患者合并AHF 的危險因素。ROC 曲線分析結(jié)果顯示血漿miR-208a 預測AHF 的AUC 為0.896(95%CI:0.844～0.948)，與BNP 比較差異無統(tǒng)計學意義，cut-off 值對應的敏感性和特異性分別為88.4%和83.3%，表明血漿miR-208a 表達水平對AHF 具有較高的預測價值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)急性STEMI 并發(fā)AHF患者血漿miR-208a 相對表達水平較無AHF 患者顯著升高，血漿miR-208a 可作為急性STEMI 患者并發(fā)AHF 的早期預測因子。 最后，本研究的不足之處在于:一方面，作為單中心研究，本研究納入樣本例數(shù)有限，研究結(jié)果可能與真實世界存在偏倚，期待后續(xù)多中心大樣本研究證據(jù)進一步驗證；另一方面，miR-208a 在AHF 發(fā)生進程中的具體生物學機制尚不明確，外周血miR-208a 表達水平增高僅是心肌細胞損傷后釋放到循環(huán)中，抑或是通過特殊信號通路導致的表達增加，仍需進一步繼續(xù)深入研究。