大豆β-伴球蛋白脫糖基化及其酶解后抗原活性變化

王章存 劉 洋 安廣杰 胡金強(qiáng) 趙學(xué)偉 賀志錚

(鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鄭州 450001)(河南省食品安全國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室2，鄭州 450001)

大豆蛋白是食品工業(yè)中常用的植物蛋白。但大豆也是國際公認(rèn)的八大過敏原食物之一，可引起人體腹瀉、皮疹、咽喉水腫和急性哮喘等癥狀[1]，影響了大豆蛋白的食用價(jià)值。大豆中的致敏成分均是蛋白質(zhì)，目前在大豆中發(fā)現(xiàn)有38種蛋白質(zhì)具有致敏現(xiàn)象。大豆中的儲藏蛋白也是主要的致敏蛋白，其中大豆β-伴球蛋白是大豆中最重要的一種抗原蛋白[2]。該蛋白是由α′(57～83 ku)、α(57～76 ku)和β(42～53 ku)3種亞基組成的分子質(zhì)量為150～210 ku的三聚體，其聚合形式包括ααα、ααα′、αα′β、ααβ、αββ、α′ββ等)[3]。常規(guī)的食品加熱和酶解處理難以消除大豆β-伴球蛋白的抗原活性[4-7]，但酶解處理相較而言是更有效的手段，能在顯著降低大豆蛋白抗原性的同時(shí)提高蛋白的多種功能特性如溶解性、乳化性、發(fā)泡性等[8，9]，風(fēng)味蛋白酶是蛋白質(zhì)酶解時(shí)常用的酶制劑之一，與其它酶制劑相比，其特點(diǎn)是可以從肽鏈羧基末端切除氨基酸，在去除苦味，改善口感的同時(shí)，還能提高蛋白有效利用率并降低生產(chǎn)成本。此外有研究表明糖基化反應(yīng)能通過大豆蛋白與糖結(jié)合后發(fā)生結(jié)構(gòu)變化降低蛋白抗原性[10]。β-伴球蛋白是含糖量約為5%的糖蛋白[11]，其3個(gè)亞基被N-糖鏈所修飾[12]，它們富含甘露糖[13]。糖基化修飾蛋白質(zhì)不僅影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運(yùn)輸和定位，而且在分子識別、細(xì)胞通信、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等特定生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14,15]，而β-伴球蛋白中的糖組分在其致敏反應(yīng)中的地位和作用是目前研究的重要內(nèi)容[16,17]。本研究通過β-伴球蛋白脫糖前后及其在酶解過程中蛋白質(zhì)分子成分和抗原性的變化，研究糖鏈對β-伴球蛋白的抗原活性的影響及其在酶解過程中的作用，為有效降低或消除大豆蛋白的抗原性提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大豆β-伴球蛋白(參考Nagano方法[18]實(shí)驗(yàn)室自制，純度約92%)，風(fēng)味蛋白酶，N-糖苷酶PNGase F，大豆β-伴球蛋白酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，考馬斯亮蘭R250，其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式磁力攪拌器，DYY-7C 型電泳儀，DYCZ-24DN型電泳槽，iMark酶標(biāo)儀，F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥機(jī)，UV-8100B紫外-可見分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 β-伴球蛋白的脫糖基化

參照Amigo-Benavent方法[17]釋放N-糖鏈。主要步驟：取β-伴球蛋白凍干樣品每8 mg溶于800 μL蛋白變性液(0.4 mol/L DTT, 5% SDS)，于沸水中加熱10 min。待樣品冷卻至室溫后，加入80 μL的磷酸緩沖液(0.5 mol/L, pH 7.5), 80 μL的NP-40(10%)和8 μL的PNGase F溶液，于37 ℃恒溫酶解24 h后100 ℃水浴加熱10 min滅酶。之后將樣品用Sep-Park C18微柱將糖和蛋白質(zhì)分離。

1.3.2 糖含量分析

苯酚-硫酸法測定。參考張惟杰方法[19]進(jìn)行。主要過程，樣品1.0 mL、6%苯酚0.5 mL、濃硫酸5.0 mL，混勻后并在室溫靜置10 min后，于490 nm處測定光吸收值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作工作曲線。

1.3.3 β-消去反應(yīng)判斷糖蛋白質(zhì)O-連接

參考文獻(xiàn)[20]方法。主要步驟是：將大豆β-伴球蛋白溶解在0.1 mol/L NaOH溶液，并于45 ℃保溫18 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，于220～270 nm進(jìn)行光譜掃描。對照樣品用水處理。比較兩種樣品在240 nm處光譜變化。

1.3.4 脫糖和原始β-伴球蛋白的酶解

β-伴球蛋白的酶解：將β-伴球蛋白配制成5 mg/mL的溶液，按1.3.1方法加入蛋白變性液并沸水浴加熱10 min。冷卻水溫至55 ℃后，用2 mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH 6.5，按照酶與蛋白質(zhì)比例1∶100(E/S)加入風(fēng)味蛋白酶，磁力攪拌器恒溫?cái)嚢柘旅附夥磻?yīng)；在酶解0、10、30、60、90、120、150、180 min時(shí)分別吸取100 μL酶解液于離心管，立即置于100 ℃水浴加熱10 min終止酶解反應(yīng)。然后樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

脫糖后β-伴球蛋白也按上述相同的方法和條件酶解、取樣和保存。

1.3.5 SDS-PAGE分析

根據(jù)Laemmli[21]的方法，采用不連續(xù)垂直SDS-PAGE系統(tǒng)。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，上樣量為15 μL。濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓110 V?？捡R斯亮藍(lán)R250染色，脫色后拍照。

1.3.6 酶解產(chǎn)物抗原活性測定

采用競爭法大豆β-伴球蛋白ELISA試劑盒測定。樣品用純水稀釋50倍后，按照試劑盒說明書的步驟操作，在酶標(biāo)儀中測定β-伴球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的OD值。每份樣品重復(fù)三次。以標(biāo)準(zhǔn)品的工作曲線計(jì)算樣品測定結(jié)果。數(shù)據(jù)采用ORIGIN 8.0軟件處理。以未酶解原β-伴球蛋白的抗原活性為基數(shù)，計(jì)算脫糖和未脫糖樣品及其酶解產(chǎn)物的抗原活性剩余率，即：抗原活性剩余率=(樣品抗原活性÷原β-伴球蛋白抗原活性)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆β-伴球蛋白的脫糖效果分析

糖與苯酚-硫酸反應(yīng)的產(chǎn)物有特征性光吸收特征，在490 nm處有最大吸光值。根據(jù)此原理，將脫糖前后的β-伴球蛋白經(jīng)硫酸-苯酚反應(yīng)后的光吸收曲線如圖1所示?？梢钥闯?，β-伴球蛋白的反應(yīng)產(chǎn)物在490 nm處吸光值較高，脫糖后的β-伴球蛋白吸光值很低，表明糖苷酶起到了較好的脫糖效果。

圖1 脫糖前后β-伴球蛋白與苯酚-硫酸反應(yīng)物光吸收特征

為了進(jìn)一步驗(yàn)證β-伴球蛋白經(jīng)脫糖酶PNGase F處理后脫下的糖含量，將脫糖樣品經(jīng)苯酚-硫酸反應(yīng)后，并用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作工作曲線，測定結(jié)果換算為β-伴球蛋白含糖量為(4.13±0.6)%，與文獻(xiàn)中報(bào)道的含糖量5%的結(jié)果接近[11]。需要說明的是，關(guān)于大豆β-伴球蛋白含糖量的文獻(xiàn)報(bào)道極少，而且除了N—連接的糖鏈外，還含有O—連接糖成分[22]。

為了進(jìn)一步確定大豆β-伴球蛋白O—糖鏈的存在，本研究通過β-消去反應(yīng)分析反應(yīng)前后蛋白質(zhì)樣品光吸收特征(圖2)。可見經(jīng)β-消去反應(yīng)后，大豆β-伴球蛋白在240 nm處凸起一個(gè)明顯的峰，表明大豆β-伴球蛋白中含有O-糖肽鍵。本研究僅采用PNGase F酶特異地切除糖蛋白中的N—糖肽鍵，它可以在釋放N—糖鏈的同時(shí)保持蛋白質(zhì)肽鏈的完整性。

圖2 大豆β-伴球蛋白經(jīng)β-消去反應(yīng)前后的光吸收曲線

2.2 脫糖前后β-伴球蛋白組分在酶解過程中的變化

將脫去N-糖鏈的大豆β-伴球蛋白和原β-伴球蛋白分別在相同的條件下，用風(fēng)味蛋白酶水解，將不同酶解時(shí)間的產(chǎn)物做SDS-PAGE，結(jié)果如圖3所示。

a 未脫糖β-伴球蛋白酶解物 b 脫糖β-伴球蛋白酶解物

從圖3可知，脫糖與未脫糖β-伴球蛋白的酶解產(chǎn)物的電泳行為有顯著差異：原β-伴球蛋白α-、和α′-亞基在酶解的初始階段很快消失，β-亞基在持續(xù)酶解180 min內(nèi)變化不大，酶解時(shí)新生成了25 ku組分，在延長酶解時(shí)間過程中，這些新成分也難以消失。這種現(xiàn)象與文獻(xiàn)中報(bào)道的用堿性蛋白酶、胃蛋白酶水解時(shí)的結(jié)果相似[7,23]。

脫糖后的β-伴球蛋白在酶解的前10 min時(shí)就幾乎完全消失，同時(shí)新生成了約37、33 ku的肽鏈，酶解90 min時(shí)又新生成25 ku組分。而原β-伴球蛋白酶解過程中沒有產(chǎn)生37、33 ku組份。Amigo-Benavent等[17]研究發(fā)現(xiàn)，用胃腸液酶解2 h后，原β-伴球蛋白β-亞基仍然存在，而脫糖后的β-伴球蛋白β-亞基則完全消失。但該文獻(xiàn)沒有考查不同酶解時(shí)間條件下兩種蛋白質(zhì)譜帶的變化規(guī)律。以上結(jié)果表明，β-伴球蛋白中糖鏈的存在，影響蛋白酶的水解行為。

2.3 脫糖與未脫糖β-伴球蛋白酶解過程中的抗原性變化

根據(jù)圖4可看出，β-伴球蛋白經(jīng)過脫糖處理后，其抗原活性明顯降低，僅有原β-伴球蛋白抗原活性的60.1%。此結(jié)果表明，β-伴球蛋白中的糖成分對其抗原活性有很大的貢獻(xiàn)。

圖4 酶解過程中原始與脫糖β-伴球蛋白的抗原活性剩余率

β-伴球蛋白酶解反應(yīng)前期抗原活性降低幅度較大，酶解90 min下降為57.0%，此階段也是α′-和α-亞基條帶逐漸消失的時(shí)間(圖3)，這一階段抗原活性的降低，可能是由于α′、α亞基被酶解后，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，構(gòu)象表位遭到破壞，也可能有序列型抗原表位被破壞，從而降低了其抗原活性。在90～180 min時(shí)，抗原活性下降的趨勢有所減弱，180 min時(shí)抗原活性剩余43.4%，可能是隨著構(gòu)象表位的減少，酶與抗原蛋白的結(jié)合位點(diǎn)也隨之減少、酶解速率下降，減小了抗原活性的下降幅度。這種變化趨勢與文獻(xiàn)中的研究結(jié)果相似[3,24]。

脫糖后的β-伴球蛋白酶解過程中抗原性的變化行為與原β-伴球蛋白也有明顯不同。雖然隨著酶解時(shí)間的延長其抗原性逐漸降低，但沒有明顯的斷崖式降低現(xiàn)象，酶解180 min后抗原活性剩余25.0%。這表明與糖鏈存在有相關(guān)性。此結(jié)果不僅支持文獻(xiàn)[25]中β-伴球蛋白去糖基化后與其IgE抗體特異性結(jié)合的活性降低或消失的結(jié)論，而且也證明蛋白質(zhì)脫糖后酶解行為與酶解產(chǎn)物的抗原活性的變化有直接關(guān)系。關(guān)于β-伴球蛋白中糖與蛋白的連接位點(diǎn)、糖鏈成分、結(jié)構(gòu)信息及其影響酶解和抗原性的機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

用PNGase F酶可以有效脫除大豆β-伴球蛋白中N-糖肽鍵，但β-消去反應(yīng)證明該蛋白質(zhì)中還有O-連接糖成分；脫糖后的蛋白抗原活性顯著降低；脫去N-糖鏈前后的β-伴球蛋白在風(fēng)味蛋白酶水解過程中，其亞基組分和抗原性的變化趨勢具有明顯差異。結(jié)果表明N-連接糖組分的存在是β-伴球蛋白具有抗原性的重要因素。