氯霉素潑尼松搽劑治療小鼠特應性皮炎的實驗研究

陳芳，袁昊，馬朝暉，陳少秀，常明泉

(1.十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學院，湖北十堰 442000)

特應性皮炎因為產(chǎn)生強烈的瘙癢感，嚴重影響患者身心健康，導致患者生活質(zhì)量下降[1-2]。兒童發(fā)病率高于成人，達20%[3]。引起特應性皮炎的因素可能有外在因素包括環(huán)境、飲食、日照等，內(nèi)在因素包括免疫功能異常、遺傳、精神等[4]。氯霉素潑尼松搽劑是十堰市太和醫(yī)院自制外用制劑，批準文號為鄂藥制字H20111437，規(guī)格10 mL，該制劑主要由醋酸潑尼松、氯霉素、無水乙醇、蓖麻油、白及多糖、清魚肝油組成，具有抗菌消炎、抗變態(tài)反應的作用[5-6]，目前主要用于膿皰瘡、蚊蟲叮咬的治療，臨床上也用于多種變態(tài)型皮膚炎癥的治療，取得了良好的效果。為了給臨床合理、安全、有效用藥提供依據(jù)，拓展臨床應用范圍，作者探索應用二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液對小鼠造模，對該制劑治療急性特應性皮炎的效果進行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

VIVASCOP 1500激光共聚焦掃描顯微鏡(皮膚CT，美國LUCID INC，波長830 nm)；TGL-16G臺式離心機(上海安亭醫(yī)療器械公司)；UV1901紫外分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)；FST型6 mm/11.5 cm耳打孔器(瑞士)；ZR-08型小鼠固定器(上海普辛儀器科技有限公司)。

1.2 試藥

低劑量氯霉素潑尼松搽劑(含氯霉素5 mg/mL、潑尼松0.25 mg/mL，臨時配制)；中劑量氯霉素潑尼松搽劑(即正常處方氯霉素潑尼松搽劑，含氯霉素10 mg/mL、潑尼松0.5 mg/mL，臨時配制)；高劑量氯霉素潑尼松搽劑(含氯霉素20 mg/mL、潑尼松1 mg/mL，臨時配制)；1%吡美莫司乳膏(德國美達醫(yī)藥股份有限公司，批號20180410)；干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、免疫球蛋白E(IgE)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(美國，Invitrogen公司，批號20180922)；二硝基氯苯(武漢江岸化試有限公司，批號20181206)；0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水，每瓶250 mL，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號U18090604-4)；丙酮(武漢江岸化試有限公司，批號20180406，化學純)；十二烷基硫酸鈉(SDS，蘇州同豐化工有限公司，批號20180922，化學純)。

1.3 實驗動物

C57BL/6/ICR小鼠，體質(zhì)量25～30 g，來源于湖北醫(yī)藥學院動物實驗中心，生產(chǎn)許可證[SCXK(鄂)2016-0008]，使用許可證[SYXK(鄂)2016-0031]。飼養(yǎng)條件：溫度20～24 ℃，相對濕度40%～70%，實驗過程中供給專用飼料及飲水，實驗期間小鼠自由飲食飲水。本研究的動物實驗在十堰市太和醫(yī)院皮膚病研究所完成。

2 方法

2.1 動物造模[7-8]

取合格小鼠48只，雌雄各半，均分為6組，即空白組、模型組、對照組及實驗低、中、高劑量組共6組各 8只，規(guī)范飼養(yǎng)7 d，實驗前1 d用電動剃須刀剃去小鼠背部及雙側(cè)耳部毛發(fā)，面積約為2 cm2，實驗第1～2天，在每只小鼠背部剃毛處涂抹1%二硝基氯苯丙酮溶液100 μL致敏，空白組涂抹不含二硝基氯苯的丙酮溶液100 μL，第3～7 天不對小鼠進行任何處理，第8～16天先用4% SDS清理小鼠背部和耳部剃毛處，待干燥，背部給予0.5% 二硝基氯苯丙酮溶液100 μL再次致敏，左耳部給予0.5%二硝基氯苯丙酮溶液25 μL致敏，空白組給予同劑量不含二硝基氯苯的丙酮溶液，至小鼠皮膚出現(xiàn)表皮剝脫、結(jié)痂、紅斑、滲出、出血，耳朵出現(xiàn)明顯腫脹，即視為造模成功。

2.2 給藥方法

造模成功24 h后，對各組小鼠給予相應藥物治療，即空白組和模型組給予生理鹽水0.05 mL/cm2，對照組給予1%吡美莫司乳膏0.05 g/cm2，實驗組低、中、高劑量組分別給予相應濃度的氯霉素潑尼松搽劑0.05 mL/cm2，每日1次，持續(xù)給藥7 d(1個療程)。

2.3 觀察指標

每次給藥前，注意觀察特應性皮炎部位的表象特征變化，記錄拍照；檢測小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-5、IgE水平；測定小鼠皮損厚度、耳腫脹度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，依據(jù)皮損程度、各項生化、病理指標的變化情況判斷氯霉素潑尼松搽劑對小鼠特應性皮炎的治療效果。

2.4 檢測方法

持續(xù)給藥7 d，末次給藥24 h后，用注射器從小鼠眼眶取靜脈血，抗凝處理后在4 ℃環(huán)境下，2 000 r/min離心 30 min，取血清于-20 ℃冷凍箱中儲存，按酶聯(lián)免疫法檢測IFN-γ、IL-4、IL-5、IgE水平，比較實驗組小鼠特應性皮炎應用氯霉素潑尼松搽劑后癥狀改善與相關生化指標變化的關系。

取上述抽血后的各組小鼠，在共聚焦掃描顯微鏡下準確定位對皮損厚度進行測定，記錄測定結(jié)果。取測定皮損厚度后的小鼠,脫頸處死，左右耳對應部位分別用直徑6 mm的打孔器打取相同面積的耳片，用分析天平稱取雙耳片質(zhì)量，計算耳腫脹度[耳腫脹度=左耳質(zhì)量(mg)-右耳質(zhì)量(mg)]；摘取胸腺和脾腺，用分析天平稱重，計算胸腺指數(shù)[胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×10]；計算脾臟指數(shù)[脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×10]。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 皮損情況觀察

用藥過程中肉眼觀察、記錄、比較各組小鼠特應性皮炎的表象變化，實驗組高、中劑量組1個療程后表皮剝脫、滲出、出血現(xiàn)象消失，結(jié)痂減少，紅斑開始變淺，耳腫脹程度減輕。

3.2 生化指標比較

治療后，實驗組IL-4、IL-5、IgE水平均受到不同程度抑制，低、中、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組IFN-γ水平升高，其中中、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 6組小鼠生化指標檢測結(jié)果 pg/mL

3.3 病理指標比較

治療后，實驗組小鼠耳腫脹度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、皮損厚度中劑量組和高劑量組與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中劑量組耳腫脹度、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、皮損厚度與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，實驗組耳腫脹度隨劑量增加依次降低，治療效果與劑量具有相關性，見表2。

表2 6組小鼠病理指標檢測結(jié)果

4 討論

特應性皮炎的發(fā)生與細菌、真菌感染、外界環(huán)境刺激、體內(nèi)毒性物質(zhì)分泌過多有關，生化、病理指標則表現(xiàn)為血清IgE水平增高，IFN-γ水平降低，Th1型細胞功能下降，Th2型細胞功能亢進，Th1/Th2細胞比例失衡[9]。特應性皮炎動物血清中IgE水平與病情嚴重程度呈正相關[10-11]，特應性皮炎癥狀加重則IgE水平升高。IFN-γ增高對IgE具有抑制作用。所以實驗組小鼠血清中的IgE水平明顯高于空白組。Th1型細胞抑制Th2型細胞合成，通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子平衡有效控制炎癥因子水平[12]。因而提高IFN-γ、降低IgE、使Th1/Th2細胞達到動態(tài)平衡對特應性皮炎的治療具有重要意義[13]。

本實驗結(jié)果顯示，氯霉素潑尼松搽劑使用1個療程后，小鼠表皮剝脫、炎性滲出、出血現(xiàn)象消失，結(jié)痂、紅斑等得到改善。從生化指標看，氯霉素潑尼松搽劑使用1個療程后，顯著提高了小鼠血清中IFN-γ水平，同時降低了IL-4、IL-5及IgE水平，也可能提高了Th1型細胞功能，抑制了Th2型細胞功能亢進，對Th1/Th2細胞因子平衡發(fā)揮了良好的調(diào)節(jié)作用。病理指標方面，氯霉素潑尼松搽劑應用1個療程后，小鼠耳腫脹度、皮損厚度與模型組比較顯著降低，中、高劑量組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比模型組顯著降低，說明氯霉素潑尼松搽劑用于小鼠特應性皮炎治療1個療程后，體征、生化指標、病理指標均獲得正向改善。

氯霉素潑尼松搽劑通過脂溶性可彌散進入細菌細胞內(nèi)抑制蛋白質(zhì)的合成而達到抗菌消炎目的；抑制、延遲細胞介導免疫反應、過敏反應，降低免疫球蛋白與細胞表面受體的結(jié)合并抑制白介素的合成與釋放而產(chǎn)生免疫抑制作用；作用于皮損部位降低細胞膜及毛細血管的通透性，從而抑制皮損部位感染；抑制毒性物質(zhì)、組胺的形成和釋放，從而抑制炎性滲出物預防感染加深。該搽劑用于耳、胸腹部，經(jīng)皮下吸收后，對因DNCB刺激引起的變態(tài)反應導致的耳腫脹、胸腺、脾腺腫大具有顯著的抑制作用，直接作用于皮損部位，對小鼠背部、左耳因DNCB刺激引起的皮膚剝脫、過敏導致的紅斑、腫脹等癥狀具有顯著的改善作用。

吡美莫司乳膏是一種治療非免疫受損的輕中度特應性皮炎藥物[14-15]，臨床應用廣泛，其療效得到充分肯定。實驗組的中、高劑量組多項治療指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明氯霉素潑尼松搽劑對特異性皮炎的治療同樣能產(chǎn)生顯著療效，根據(jù)實驗結(jié)果推論，氯霉素潑尼松搽劑在臨床上可用于特應性皮炎、變態(tài)反應性皮炎、濕疹的治療。