坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷動(dòng)物模型的不同制備方法比較＊

劉柏彤，張 薇，蔣一璐，蔡定均

（成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 成都 610075）

神經(jīng)病理性疼痛（Neuropathic pain，NPP）是由影響體感神經(jīng)系統(tǒng)的病變或疾病引起的，主要表現(xiàn)為感覺(jué)功能障礙，如自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏、異常疼痛等，在成年人中發(fā)病率為6%-8%。神經(jīng)病理性疼痛與生活質(zhì)量低下及現(xiàn)有藥物相對(duì)保守的療效反應(yīng)相關(guān)。由于其癥狀表現(xiàn)的多樣化及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，故為科學(xué)研究中的難點(diǎn)之一[1,2]。為了預(yù)防和治療NPP，我們需要清楚NPP的發(fā)病機(jī)制、治療方法及其起效機(jī)制。目前研究NPP 最常用的動(dòng)物模型為中樞疼痛模型、周?chē)窠?jīng)損傷模型以及與化療、抗艾滋病治療和糖尿病相關(guān)的外周神經(jīng)痛模型[3]。坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷（Chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI）模型屬于周?chē)窠?jīng)損傷模型，且模型穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好[4]，故本文選擇CCI模型作為研究對(duì)象。坐骨神經(jīng)走行過(guò)程中任何地方的紊亂都可引起坐骨神經(jīng)痛，最常見(jiàn)的部位是在L4-L5和L5-S1水平，較少出現(xiàn)的是在L3-L4 水平。坐骨神經(jīng)損傷也會(huì)在下盆腔、臀部、臀溝和股二頭肌等部位發(fā)生。在不同的研究中，坐骨神經(jīng)痛的患病率差異很大，最高的發(fā)病率為40%，大多數(shù)情況發(fā)生在40-60 歲[5]。筆者以坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷動(dòng)物模型為例，通過(guò)結(jié)合文獻(xiàn)及筆者的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，分析比較不同造模方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，以期對(duì)CCI動(dòng)物模型的研究提供指導(dǎo)。

1 動(dòng)物與制備方法的選擇

1.1 動(dòng)物選擇

選擇一個(gè)合適的載體非常重要，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇會(huì)直接影響到模型成功與否及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌_(kāi)展，選擇一個(gè)合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以準(zhǔn)確復(fù)制出與人類相同或相似的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于治療起效機(jī)制的研究具有指導(dǎo)意義。因此，首先應(yīng)考慮如何選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇應(yīng)該考慮兩個(gè)因素，一是種屬，二是性別。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的選擇還應(yīng)考慮到動(dòng)物對(duì)造模方法的敏感性、特異性、穩(wěn)定性及經(jīng)濟(jì)等要素[6]。根據(jù)文獻(xiàn)，目前常用來(lái)制作CCI 模型的動(dòng)物有大鼠、小鼠、家兔等。每種動(dòng)物CCI 模型都具有各自特點(diǎn)：①大鼠性情溫順，生存能力強(qiáng)，體型相對(duì)較大，模型成功率較高，是CCI 模型的理想載體。②小鼠生存能力及繁殖力極強(qiáng)，基因組測(cè)序表明小鼠與人類平均85%的基因序列高度一致[7]，故小鼠也是CCI 模型較理想的載體。但小鼠體型較小，下肢較細(xì)，坐骨神經(jīng)也較細(xì)，不利于觀察研究。③家兔性情溫順，生存能力強(qiáng)，且家兔下肢相對(duì)較大，便于模型的制備；但相對(duì)于大鼠和小鼠，手術(shù)的復(fù)雜程度要更高。而動(dòng)物性別差異同樣也會(huì)對(duì)CCI 產(chǎn)生影響，如雌性動(dòng)物的雌激素水平會(huì)影響到其對(duì)疼痛刺激的敏感性[8]，因此，除特殊研究需要外，應(yīng)選擇雄性動(dòng)物。

1.2 制備方法

CCI 動(dòng)物模型一般與空白組和假手術(shù)組相比較。假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)，而不做其他處理。CCI 動(dòng)物模型的制備方法可以分為兩大類：坐骨神經(jīng)結(jié)扎法和硅膠管環(huán)形擠壓法。結(jié)扎法易于上手，模型可獲得較高的穩(wěn)定性；但是缺點(diǎn)在于實(shí)際操作中需要準(zhǔn)確的手感，若處理不當(dāng)容易造成模型不成功或坐骨神經(jīng)損傷。硅膠管環(huán)形擠壓法易于操作，且受到外力影響較小，故成功率較結(jié)扎法高。但硅膠管存在容易脫落的情況，會(huì)影響模型的成功；且在一定程度上會(huì)影響模型的熱痛敏和異常性機(jī)械痛敏[9]。

此兩種方法在操作難度、模型穩(wěn)定及成功率等方面各有其特點(diǎn)及優(yōu)缺點(diǎn)，故應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇。

2 動(dòng)物模型制備

2.1 大鼠CCI模型的制備

2.1.1 大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎法

Bennett 和Xie 的大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎法[10]是最經(jīng)典的方法，是將大鼠坐骨神經(jīng)主干部位鈍性分離出來(lái)，用4-0 鉻制羊腸線結(jié)扎，每?jī)傻乐g間隔約1 mm。大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎法根據(jù)結(jié)扎數(shù)量不同，又分為兩種方法，分別為結(jié)扎3道和結(jié)扎4道。

（1）結(jié)扎4道

Bennett 等[10]在手術(shù)后1-7 天，觀察到大鼠的步態(tài)有很大變化，受影響的后爪在行走時(shí)笨拙、跛行，在行走或站立時(shí)分開(kāi)的腳趾則會(huì)蜷縮，并稍微外翻。大約1周后，跛行有所改善，腳趾蜷縮，外翻明顯，大多數(shù)大鼠表現(xiàn)出輕度至中度的足下垂，并持續(xù)2個(gè)多月，且腳趾蜷縮越來(lái)越緊。4-6 周后跛行逐漸改善，但大鼠依然用后爪外翻行走。結(jié)扎后第2 天開(kāi)始，結(jié)扎側(cè)的后爪機(jī)械痛閾明顯降低，術(shù)后2個(gè)月后仍存在這種現(xiàn)象，但痛覺(jué)過(guò)敏程度逐漸減弱。至3-4 個(gè)月后，后肢出現(xiàn)痛覺(jué)減退。何林峰等[11]觀察到模型組大鼠于術(shù)后7天，機(jī)械痛閾和熱痛閾值表現(xiàn)為降低趨勢(shì)，并且持續(xù)2周的時(shí)間（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。

（2）結(jié)扎3道

韓光等[12]將大鼠分為假手術(shù)組和模型組，觀察到術(shù)后1-7天，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾值都顯著降低。術(shù)后3天左右的機(jī)械痛閾和熱痛閾值下降幅度最大，后逐漸趨于平穩(wěn)；林志剛等[13]觀察CCI模型組大鼠造模后17天內(nèi)機(jī)械足反射閾值（Paw withdrawal threshold，PWT），發(fā)現(xiàn)1、3、5、7、10天PWT 持續(xù)下降，于第10 天到達(dá)最低水平，于后保持在較平穩(wěn)水平，與空白組對(duì)比具有顯著差異（P＜0.01）；術(shù)后第18天觀察到CCI模型組腓腸肌細(xì)胞橫截面積明顯小于空白組（P＜0.05）；且術(shù)后第18 天觀察到背根神經(jīng)節(jié)的P 物質(zhì)（substance P，SP）含量較空白組、假手術(shù)組明顯升高（P＜ 0.05）

2.1.2 大鼠坐骨神經(jīng)硅膠管環(huán)形擠壓法

經(jīng)典的神經(jīng)卡壓損傷模型是Mackinnon 等[14-16]設(shè)計(jì)的硅膠管卡壓造成的神經(jīng)慢性損傷模型。是將已消毒的硅膠管（長(zhǎng)度為5 mm，管內(nèi)徑與大鼠坐骨神經(jīng)直徑基本一致）套住大鼠坐骨神經(jīng)，并用縫合線將硅膠管固定以環(huán)形擠壓坐骨神經(jīng)。O'Brien 等[16]發(fā)現(xiàn)造模3個(gè)月時(shí)，可見(jiàn)套管處神經(jīng)受到壓迫，遠(yuǎn)端和近端的神經(jīng)輕微腫脹，套管處神經(jīng)被觸碰時(shí)稍顯緊張，最明顯的是第8個(gè)月和第12個(gè)月。造模后大鼠第1個(gè)月的組織學(xué)評(píng)估結(jié)果為正常，5個(gè)月時(shí)神經(jīng)束膜增厚，中央纖維正常，在神經(jīng)束的頂端可見(jiàn)明顯的脫髓鞘；3個(gè)月時(shí)，模型組神經(jīng)傳導(dǎo)速度增加，在5-12個(gè)月時(shí)，速度和振幅逐漸下降，模型組和對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。楊書(shū)蔚等[17]發(fā)現(xiàn)造模后第14 天和28天，與空白組比較，造模大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（Sciatic functional Index，SFI）明顯降低（P＜ 0.01）。造模后第28天各組大鼠坐骨神經(jīng)病理形態(tài)比較：空白組坐骨神經(jīng)纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)緊密，軸索位于神經(jīng)內(nèi)膜中間，各結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)；模型組坐骨神經(jīng)纖維及髓鞘排列混亂，髓鞘、軸突出現(xiàn)崩解，部分變形呈空泡狀，雪旺細(xì)胞增多。

2.2 小鼠CCI模型制備

小鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎法與大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎法類似，同樣也分為結(jié)扎3道和結(jié)扎4道。

2.2.1 結(jié)扎4道

羅裕輝等[18]發(fā)現(xiàn)手術(shù)后第4 天模型組小鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾值都比假手術(shù)組明顯降低（P＜0.05），并一直持續(xù)到手術(shù)后第6 天。龔華磊等[19]通過(guò)測(cè)量得到造模前假手術(shù)組小鼠手術(shù)側(cè)、對(duì)側(cè)和CCI 組小鼠結(jié)扎側(cè)、對(duì)側(cè)后爪機(jī)械痛閾和熱痛閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后7 天，對(duì)比假手術(shù)組小鼠手術(shù)側(cè)、對(duì)側(cè)和CCI組小鼠結(jié)扎側(cè)、對(duì)側(cè)后爪機(jī)械痛閾和熱痛閾值。發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組結(jié)扎側(cè)比較，CCI 組小鼠患側(cè)后爪機(jī)械痛閾和熱痛閾值明顯降低（P＜0.05）；造模后7 天，假手術(shù)組小鼠手術(shù)側(cè)、對(duì)側(cè)和CCI 組小鼠結(jié)扎側(cè)、對(duì)側(cè)DRGZHX2 蛋白的表達(dá)不同（P＜ 0.05）。與假手術(shù)組手術(shù)側(cè)比較，CCI組小鼠結(jié)扎側(cè)DRGZHX2蛋白的表達(dá)增加2.15倍（P＜ 0.05）。

2.2.2 結(jié)扎3道

李永豐等[20]發(fā)現(xiàn)CCI 組小鼠痛閾比假手術(shù)組顯著降低，術(shù)后14天機(jī)械痛閾和熱痛閾值均降至最低（P＜0.01）；術(shù)后4 天時(shí)測(cè)得Western blot 結(jié)果為損傷區(qū)CB1受體的表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.01），并于7、11 和14天保持較高水平，與手術(shù)前相比有差異（P＜0.05）。楊寧等[21]的實(shí)驗(yàn)中與空白對(duì)照組比較，模型組造模后第1、8、22天的痛閾值明顯下降（P＜ 0.05）。

2.3 家兔CCI模型制備

家兔坐骨神經(jīng)結(jié)扎法與大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎法類似。吳文駿等[22]得到家兔造模3 天后改良Tarlov 評(píng)分及趾張反射評(píng)分明顯降低，2周后開(kāi)始恢復(fù)，6-8周后，趾張反射及步態(tài)基本恢復(fù)，針刺反應(yīng)和外力對(duì)抗恢復(fù)情況不理想，造模后10 周，家兔各項(xiàng)指標(biāo)基本達(dá)到正常水平。

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛（Neuropathic pain，NPP）占各類慢性疼痛的30%以上，是醫(yī)護(hù)人員在臨床工作中遇到的常見(jiàn)疼痛類型[23]。不同類型的免疫細(xì)胞如肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等在NPP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[24]。研究NPP 的重要一步是建立NPP 動(dòng)物模型，而CCI 模型是研究NPP 的經(jīng)典模型。在CCI模型中，擠壓神經(jīng)導(dǎo)致化學(xué)促炎物質(zhì)釋放，以侵襲神經(jīng)組織，最終導(dǎo)致神經(jīng)炎和神經(jīng)肥厚，引起機(jī)械痛敏和熱過(guò)敏的現(xiàn)象[4]，與NPP 的發(fā)病機(jī)制相同或類似，具有較高的代表性。目前CCI 模型常用的動(dòng)物載體有大鼠、小鼠、家兔等；CCI 動(dòng)物模型的制備最常用的是坐骨神經(jīng)結(jié)扎法和硅膠管環(huán)形擠壓法，各具特點(diǎn)。

坐骨神經(jīng)結(jié)扎法較常用。根據(jù)筆者的實(shí)踐經(jīng)歷，結(jié)扎時(shí)應(yīng)注意，要注意結(jié)扎的松緊程度，以免造成造模不成功或損傷坐骨神經(jīng)，影響機(jī)械痛閾和熱痛閾值的結(jié)果，甚至造成肢體遠(yuǎn)端缺血腫脹，甚至壞死，以致動(dòng)物啃咬結(jié)扎側(cè)腳趾。這就需要操作者的大量練習(xí)和觀察。從結(jié)扎使用的羊腸線到結(jié)扎時(shí)對(duì)手感的把控及對(duì)神經(jīng)外膜血運(yùn)的觀察，再到結(jié)扎完成后對(duì)模型的觀察以及相關(guān)測(cè)量分析，都需要不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)。結(jié)扎時(shí)用的羊腸線需事先在生理鹽水里浸泡，不僅可以防止打結(jié)，而且相對(duì)于未浸泡的羊腸線，更容易體會(huì)結(jié)扎的松緊程度；觀察神經(jīng)外膜血運(yùn)是最直觀的觀察方式，可觀察到有一條動(dòng)脈和一條靜脈伴行，靜脈肉眼隱約可見(jiàn)；動(dòng)脈則需用體視顯微鏡觀察。結(jié)扎完畢將大鼠下肢靜置幾分鐘，若靜脈變得比較清晰則表明結(jié)扎松緊度合適；如有充血現(xiàn)象，則表明結(jié)太緊了[9]。家兔和大鼠的坐骨神經(jīng)較粗，結(jié)扎相對(duì)容易；而小鼠的坐骨神經(jīng)較細(xì)，在結(jié)扎中應(yīng)注意避免造成坐骨神經(jīng)的損傷。筆者在搜集文獻(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)扎法在大鼠和小鼠模型中運(yùn)用時(shí)都分為結(jié)扎3 道和結(jié)扎4 道，根據(jù)文獻(xiàn)反饋的結(jié)果來(lái)看，結(jié)扎3 道和結(jié)扎4 道均可制備出較滿意的CCI 模型，兩種方法對(duì)于造模結(jié)果無(wú)顯著差別；但結(jié)扎4 道對(duì)于動(dòng)物行為學(xué)的影響比結(jié)扎3 道久，更適用于長(zhǎng)期觀察。

硅膠管環(huán)形擠壓法中硅膠管本身直徑固定且無(wú)彈性，故不存在外力影響壓迫效果的情況；但硅膠管相對(duì)于結(jié)扎用的腸線體型較大，產(chǎn)生炎性疼痛的可能性增大，在一定程度上會(huì)影響模型的熱痛敏和異常性機(jī)械痛敏，且容易出現(xiàn)脫落和半脫落的情況。這需要操作者在制備模型時(shí)考慮到硅膠管的固定問(wèn)題，同時(shí)又不能對(duì)硅膠管產(chǎn)生外力以影響模型的復(fù)制。筆者搜集到僅有大鼠采用此方法制備CCI 模型，小鼠沒(méi)有采用此方法或許與其坐骨神經(jīng)太細(xì)太短，沒(méi)有相配套的硅膠管有關(guān)；而家兔的CCI 模型在搜集資料時(shí)得到的文獻(xiàn)較少，還欠缺相關(guān)研究。但是根據(jù)目前搜集到的文獻(xiàn)，家兔坐骨神經(jīng)結(jié)扎后10 周各項(xiàng)指標(biāo)基本恢復(fù)[22]，與家兔的恢復(fù)能力強(qiáng)有關(guān)，所以家兔的坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型不利于時(shí)間跨度較大的實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)已有文獻(xiàn)，坐骨神經(jīng)結(jié)扎法造模后大鼠會(huì)出現(xiàn)足外翻或蜷縮的現(xiàn)象，在一定程度上會(huì)影響熱痛閾的測(cè)量，而采用硅膠管環(huán)形擠壓法造模的大鼠足印長(zhǎng)度（Print length，PL）、中間足趾距離（Inter-toes distance，IT）增長(zhǎng)[25]，對(duì)于熱痛閾測(cè)量的影響相對(duì)小。坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠于術(shù)后第1天即可出現(xiàn)機(jī)械痛閾和熱痛閾值降低等行為學(xué)改變，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；就目前收集到的文獻(xiàn)，采用硅膠管環(huán)形擠壓法制備的CCI 模型大鼠最早于第9 天可觀察到有行為學(xué)的改變[25]，較之坐骨神經(jīng)結(jié)扎的大鼠更晚；但坐骨神經(jīng)結(jié)扎的大鼠于3-4 個(gè)月后，后肢出現(xiàn)痛覺(jué)減退[10]；而硅膠管環(huán)形擠壓坐骨神經(jīng)的大鼠痛覺(jué)過(guò)敏可持續(xù)至12 個(gè)月[25]。故坐骨神經(jīng)結(jié)扎法適用于CCI 大鼠疼痛模型急性期觀察，而硅膠管環(huán)形壓迫法適用于長(zhǎng)期及慢性疾病觀察和研究。但是采用坐骨神經(jīng)結(jié)扎法制備的動(dòng)物模型存在“自噬”現(xiàn)象，容易產(chǎn)生組織破壞和感染，影響觀察結(jié)果。王金保等[26]改良了這種方法，先用多孔膠片包裹需結(jié)扎的部位，再行用羊腸線結(jié)扎，減少了動(dòng)物的“自噬”現(xiàn)象，但運(yùn)用此方法的后續(xù)報(bào)道較少，這種方法與傳統(tǒng)方法是否存在差異目前尚不清楚。硅膠管環(huán)形擠壓法制備的動(dòng)物模型未看到動(dòng)物被報(bào)道出現(xiàn)“自噬”現(xiàn)象，可有效減少其他因素的干擾。

坐骨神經(jīng)損傷常由腰骶部脊柱疾病、椎管內(nèi)病變、腰骶軟組織勞損引起，臨床以椎間盤(pán)突出、梨狀肌綜合征引起者最為多見(jiàn)。目前制備CCI模型的大鼠均在大鼠大腿外側(cè)將大鼠坐骨神經(jīng)主干部分分離出來(lái)，或用羊腸線結(jié)扎，或用硅膠管固定環(huán)形擠壓，其作用機(jī)理和表現(xiàn)與梨狀肌綜合征更為相似。梨狀肌綜合征急性期，患者在臀部或腰骶部感覺(jué)到沿坐骨神經(jīng)的放射性疼痛，下肢不能伸直，步履跛行[27,28]。這種臨床表現(xiàn)與采用坐骨神經(jīng)結(jié)扎法制備CCI模型的大鼠出現(xiàn)的縮足、跛行甚至足外翻，痛覺(jué)過(guò)敏持續(xù)2個(gè)月后逐漸消失[10]的表現(xiàn)相似。而梨狀肌綜合征慢性期患者則表現(xiàn)出小腿外側(cè)的疼痛、麻木、乏力等癥狀，甚至出現(xiàn)足下垂的表現(xiàn)[28,29]。采用硅膠管環(huán)形擠壓法制備出的CCI 模型大鼠會(huì)有PL、IT 增長(zhǎng)的表現(xiàn)，且造模后的熱痛閾和機(jī)械痛閾自第9 天開(kāi)始趨于穩(wěn)定，癥狀可持續(xù)12 個(gè)月[25]，都與梨狀肌綜合征慢性期患者的臨床表現(xiàn)相似。但是坐骨神經(jīng)結(jié)扎法制備CCI 模型的大鼠于3-4 個(gè)月患肢會(huì)出現(xiàn)痛覺(jué)減退[10]，也與慢性梨狀肌綜合征患者臨床表現(xiàn)相似，只是目前文獻(xiàn)關(guān)于長(zhǎng)期觀察這種方法制備CCI大鼠的記錄較少、癥狀描述較少，故無(wú)法對(duì)應(yīng)。而且目前對(duì)于CCI 模型評(píng)價(jià)方法較單一，一般僅觀測(cè)熱痛閾和機(jī)械痛閾的改變，但是臨床上坐骨神經(jīng)痛患者的臨床表現(xiàn)更多樣，這也是后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要完善的地方。

總之，研究NPP 的重要基礎(chǔ)首先就是要建立起滿意的NPP 動(dòng)物模型，模型的建立也可以保證研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前復(fù)制CCI 動(dòng)物模型的方法經(jīng)典且成熟，但是某些動(dòng)物的造模方法過(guò)于單一，且不能完全模擬人的發(fā)病機(jī)制，而且在實(shí)際操作中遇到一些無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化和模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)欠完善的問(wèn)題，仍需我們繼續(xù)探索和創(chuàng)新。