非洲豬瘟防控與疫苗研制最新進展

步志高/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

在6 月19 日由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸藥協(xié)會聯(lián)合舉辦的第八屆中國獸藥展覽會主題報告會上，哈爾濱獸醫(yī)研究所步志高所長應(yīng)邀作《非洲豬瘟防控與疫苗研制進展》專題報告。

1 非洲豬瘟疫苗的研制進展

步志高所長首先強調(diào)了非洲豬瘟疫苗研發(fā)的重要性并介紹了非洲豬瘟疫苗的研制進展。

一是完成候選的疫苗實驗室研究及中間試制。2018 年10 至11 月，分離獲得我國流行非洲豬瘟病毒株，完成了全基因組序列測定和分析，建立了感染發(fā)病模型；2018 年11 月至2019 年5 月，以我國流行毒株為基礎(chǔ)，經(jīng)系統(tǒng)安全性和有效性研究，篩選出1 株安全有效的弱毒疫苗HLJ/18-7GD 株；2019年6 月至2020 年2 月，初步完成了疫苗實驗室產(chǎn)品質(zhì)量研究、大規(guī)模生產(chǎn)工藝研究及中間試制、生物安全評價中間試驗。

二是安全評價完成環(huán)境釋放和第一階段臨床實驗。2020 年3 月24 日始，先后在黑龍江、河南和新疆的4 個獨立豬場開展生物安全評價環(huán)境釋放試驗和第一階段臨床試驗，包括育肥豬3077 頭、能繁母豬28 頭和家雜野豬25 頭。

三是完成安全評價生產(chǎn)性試驗和第二階段臨床試驗。2020 年10 日3 日起，先后在黑龍江、河北和湖北5 個試驗豬場開展安全評價生產(chǎn)性試驗和第二階段臨床試驗，育肥豬11410 頭、母豬201 頭；黑龍江肇州、湖北武昌、河北巨鹿和黑龍江雙城四個基地育肥豬試驗已順利完成，有關(guān)樣品檢測、數(shù)據(jù)分析、總結(jié)報告等有序推進中；母豬安全評價生產(chǎn)性試驗已完成第一胎，第二胎試驗有序進行之中。

2 非洲豬瘟疫苗研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)

步志高所長表示，當前非洲豬瘟疫苗研發(fā)主要面臨以下挑戰(zhàn)：非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)龐大復(fù)雜，基因組超過180Kb，約編碼150 余個潛在基因；滅活或亞單位疫苗難以誘導(dǎo)中和抗體，難以提供有效保護，弱毒疫苗理論上更具可行性；病毒只感染并致死豬和野豬，體外只能在豬原代巨噬細胞增殖，難以通過傳代致弱途徑獲得安全有效弱毒疫苗；通過精準刪除毒力和免疫抑制基因，獲得安全有效弱毒疫苗是目前相對可行的技術(shù)路線。

3 非洲豬瘟弱毒疫苗構(gòu)建策略

步志高所長介紹了非洲豬瘟弱毒疫苗構(gòu)建策略和1 種7 基因聯(lián)合缺失方案成功構(gòu)建候選弱毒疫苗，經(jīng)研究，該疫苗不致死不致病SPF 豬，遺傳穩(wěn)定，體內(nèi)連續(xù)傳代不返強，免疫豬對強毒致死攻擊提供有效保護。

研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟基因II型低致死自然突變株臨床癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、癱瘓、皮膚腫塊、皮膚壞死。較低劑量不致死，較高劑量致死率40%～60%。國內(nèi)自然變異株為CD2v 編碼核苷酸突變或缺失HAD 表型喪失。

HLJ/18-7GD 免疫有效阻斷低致死自然變異株水平傳播

第一階段田間試驗包括育肥豬、母豬及野豬安全評價環(huán)境釋放試驗和針對商品育肥豬的安全性、有效性臨床試驗。

2020 年3 月23 日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準在黑龍江、河南和新疆三個封閉基地開展首期臨床試驗，先后入組2962 頭育肥仔豬，分別于4 月6 日、5 月10 日和6 月8 日啟動免疫。大慶肇州31-37日齡育肥豬1060 頭，4 月6 日首免；洛陽孟津39-47 日齡育肥豬562 頭，5月10 日首免；石河子150 團37-43 日齡育肥豬1340 頭，6 月8 日首免。商品育肥豬3000 余頭，能繁母豬28 頭及其分娩仔豬和家雜野豬25 頭均嚴格生物安全隔離，不得銷售或利用，全部無害化處理。

第二階段田間試驗是育肥豬、母豬生物安全生產(chǎn)性試驗和商品豬的安全性、有效性臨床試驗。

2020 年8 月20 日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準進入生物安全評價生產(chǎn)性試驗階段。黑龍江省兩個封閉試驗基地先后入組3400 頭育肥仔豬及201 頭懷孕母豬，自10 月3 日起先后注苗，開展田間環(huán)境下的生物安全生產(chǎn)性試驗。黑龍江省肇州市及牡丹江市生物安全生產(chǎn)性試驗10 月3 日首免。

2020 年9 月18 日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準在黑龍江、河北和湖北等四個臨床試驗封閉基地開展第二階段臨床試驗，先后入 組7900 頭、2020 頭和1970 頭育肥仔豬，分別于10 月4 日、10 月18 日和10 月18 日啟動免疫。大慶肇州和雙城31～37 日齡育肥豬7900 頭，10 月4 日首免（哈獸研ABSL-3 攻毒評價）；河北巨鹿基地37～43 日齡育肥豬2020 頭，10 月18 日首免（中國ACDC ABSL-3 攻毒評價）；河北武漢基地39～47 日齡育肥豬1970 頭，10 月18 日首免。商品育肥豬3000 頭能繁母豬200 頭及其生產(chǎn)仔豬均嚴格生物安全隔離，不得銷售或利用，全部無害化處理。

結(jié)果表明第一階段臨床試驗攻毒保護效力：單劑量（5.0lg）一次接種，2個月后攻毒存活保護50%左右；單劑量（5.0lg）兩次接種，2 個月后攻毒存活保護80%以上；10 倍劑量（6.0lg）一次接種，2 個月后攻毒存活保護80%以上。

4 疫苗對商品育肥豬具有良好的安全性

團隊先后在五省區(qū)的8 個豬場開展共14487 頭商品育肥豬的田間試驗，分別觀測132 天至184 天。并對田間試驗100 萬余豬次臨床觀察記錄、910頭豬2.5 萬余次體溫記錄和2100 頭豬剖檢觀察記錄的數(shù)據(jù)分析表明：疫苗接種對育肥豬生長無顯著影響，未觀察到因疫苗接種引起的明顯臨床異常及病理損傷。

在第一階段育肥豬臨床試驗中，疫苗接種豬及其同居豬平均死淘率為2.6%，對照組豬平均為1.8%。

第二階段育肥豬臨床試驗中，疫苗接種豬及其同居豬平均死淘率為13.4%，對照豬為14.1%。

結(jié)果表明：疫苗接種豬和同居豬的死淘率與對照豬無顯著差異。

試驗豬群的豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）的混合感染普遍，繼發(fā)細菌性疾病情況復(fù)雜。臨床試驗豬群的總體死淘率與相同來源仔豬、相似養(yǎng)殖環(huán)境場豬群的平均水平相當。疫苗接種組和同居組與對照組無顯著性差異，表明疫苗接種對豬群死淘率無影響。

隨機選取850 頭育肥豬定期稱重監(jiān)測疫苗接種后體重增長情況。疫苗接種后4 個月，免疫豬、同居豬和對照豬平均體重分別為111.0±10.9kg、113.3±9.7kg 和109.9±11.2kg，平均日增重分別為0.81±0.10kg、0.83±0.08kg和0.80±0.10kg。免疫接種豬、同居組豬及對照豬之間無顯著性差異，表明疫苗接種對育肥豬生產(chǎn)性能無影響。

按照試驗方案，疫苗接種后至出欄前，定期采集試驗豬抗凝血液、口肛拭子及剖檢組織樣品60000 余份，檢測疫苗毒核酸。疫苗接種后在育肥豬體內(nèi)呈低水平復(fù)制，可在部分免疫豬口肛拭子中檢測到疫苗病毒核酸，主要在接種后5 周內(nèi)，無持續(xù)排毒。

田間試驗中，疫苗以0.1-10 倍劑量共接種11880 頭商品育肥豬，接種后分別觀測132 天至184 天不等，未觀察或檢測到疫苗毒株毒力返強。疫苗接種后定期采集血清樣品7500 余份，檢測非洲豬瘟及其他5 種重要豬病原共8種特異抗體。

疫苗接種后第1、2 和3 個月，非洲豬瘟疫苗特異抗體轉(zhuǎn)陽率分別為69.1%（661/957）、80.6%（684/849）

和93.0%（824/886）。單劑量和10 倍劑量同居豬（與疫苗接種豬同圈混養(yǎng)的未接種豬）同居飼養(yǎng)1、2 和3 個月抗體轉(zhuǎn)陽率分別為0%（0/204）、1.2%（2/172）和4.4%（8/180）。

疫苗接種豬同舍飼養(yǎng)的未接種疫苗對照豬以上3 個時間點均未檢測到抗體轉(zhuǎn)陽（0/429）。結(jié)果表明，疫苗傳播能力低，無連續(xù)水平傳播能力。非洲豬瘟弱毒疫苗接種對豬瘟、豬藍耳病、口蹄疫、偽狂犬和圓環(huán)病毒等其它常規(guī)疫苗接種免疫效果無干擾。

免疫育肥豬對強毒致死攻擊提供有效保護。

田間試驗期間，免疫接種育肥豬先后8 次分別轉(zhuǎn)運至哈獸研和中國動物CDC 的生物安全實驗室，采用非洲豬瘟強毒致死攻擊保護試驗。結(jié)果，存活保護率82.6%至100%，平均89.3%（143/160）；單劑量—次接種保護持續(xù)期2 個月以上。

步志高所長表示弱毒苗對母豬及生產(chǎn)仔豬健康和生產(chǎn)性能無影響。

團隊先后在黑龍江北安市和牡丹江市的2 個豬場開展能繁母豬農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價環(huán)境釋放試驗和生產(chǎn)性試驗，分別設(shè)單劑量接種組、10倍劑最接種組及未接種對照組。疫苗接種后，環(huán)境釋放試驗28 頭母豬觀察了183 天，生產(chǎn)性試驗201 頭母豬已觀察217 天。疫苗接種母豬后未觀察到慢性或急性臨床不良反應(yīng)，生長狀況良好，發(fā)情與受孕及胚胎發(fā)育正常。

疫苗接種母豬流產(chǎn)率為1.23%，單胎平均產(chǎn)仔數(shù)及健仔率分別為11.58 及7.3%；對照母豬的流產(chǎn)率為2.56%；單胎平均產(chǎn)仔數(shù)及健仔率分別為11.6 及87.6%；疫苗接種組與對照組相比無顯著性差異，與提供試驗?zāi)肛i場同期的另外504 頭母豬相當。目前生產(chǎn)性試驗?zāi)肛i免疫后第二胎試驗仍在繼續(xù)進行中。

生產(chǎn)性試驗中，隨機選取測定901頭仔豬出生重，760 頭仔豬斷奶重。疫苗免疫組母豬產(chǎn)仔豬與對照組母豬產(chǎn)仔豬相比均無顯著性差異。

生產(chǎn)性試驗中，隨機選取單劑量接種母豬18 胎和10 倍劑量母豬7 胎的新生仔豬，每胎隨機選取3 頭剖檢，檢測血液和組織中疫苗毒核酸。結(jié)果陽性仔豬比例單劑量母豬組為11.1%（6/54），10 倍劑量組母豬組為19.0%（4/21），陽性仔豬主要來自妊娠中后期接種母豬。

進一步對新生仔豬血液、口肛拭子和臟器樣品等進行跟蹤監(jiān)測，結(jié)果表明，疫苗毒在仔豬出生后2 個月內(nèi)均被機體有效清除。

環(huán)境釋放試驗?zāi)肛i分娩仔豬隨機選取30 頭觀察至142 日齡。生產(chǎn)性試驗?zāi)肛i分娩仔豬23 窩共219 頭已觀察至127 日齡。臨床表現(xiàn)，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示死淘率、增重等指標均無異常。疫苗接種對繁殖母豬發(fā)情、受孕、妊娠無影響；對母豬產(chǎn)仔數(shù)、健仔率及仔豬出生重、斷奶重等生產(chǎn)指標無影響。

初步可得出如下結(jié)論：

1.通過實驗室1100 余頭SPF 豬安全性和有效性實驗研究，以及田間14487 頭商品育肥豬和229 頭能繁母豬試驗，已有的數(shù)據(jù)表明，非洲豬瘟弱毒疫苗（HLJ/18-7GD 株）遺傳穩(wěn)定，接種后不致病、不返強，對育肥豬生長發(fā)育、增重和死淘等無不良影響；對田間商品豬存活保護率80%以上。

2.對接種母豬繁殖性能無明顯影響，對分娩仔豬健康狀況及生產(chǎn)性能無明顯異常。鑒于繁殖母豬生產(chǎn)利用周期長達3-5 年，疫苗接種的持續(xù)影響有待進一步觀測。

3.大規(guī)模生產(chǎn)工藝可行，質(zhì)量可控，成本經(jīng)濟，已具備生產(chǎn)應(yīng)用條件。

步志高所長在會議中建議疫苗限用于全進全出商品育肥豬。暫不用于繁殖用的母豬及種公豬。

步志高所長強調(diào)，要高度重視、積極推進非洲豬瘟疫苗研發(fā)工作，堅持尊重科學(xué)規(guī)律，堅持時間服從質(zhì)量，嚴格按照程序開展研發(fā)工作，確保疫苗的安全性、有效性，確保經(jīng)得起科學(xué)和實踐檢驗，為生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展作出貢獻。