槲皮素-替米考星混合物納米粒的制備及對金黃色葡萄球菌小菌落變異株抗菌活性研究

劉金環(huán)，張珊玲，宋 瑋，羅萬和,2，陳 偉,2,3

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，阿拉爾 843300）

由金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，S.aureus）引起的奶牛乳腺炎導(dǎo)致全球每天損失380 t牛奶[1-2]。更嚴重的是，金黃色葡萄球菌常以小菌落變異株（Staphylococcusaureussmall colony variants，SASCVs）的形式在機體內(nèi)持續(xù)存在，并形成生物被膜。研究表明，成膜的SASCVs菌株對抗菌藥物和宿主免疫系統(tǒng)的清除作用有更強的抵抗力，進而導(dǎo)致奶牛反復(fù)和長期感染乳腺炎[3]。體外藥敏試驗結(jié)果表明，替米考星對金黃色葡萄球菌具有較強的抗菌活性，其最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為2.2 μg/mL[4]。但替米考星具有較大的苦味，味覺敏感的動物口服替米考星時，容易拒食和引起反胃[5]。更為嚴重的是，替米考星難以穿透生物被膜，直接作用于SASCVs菌株。故臨床上，替米考星對SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎療效相對較差[6]。

作為黃酮醇類化合物的槲皮素具有多種生物活性，能抑制細菌胞外多糖基質(zhì)的產(chǎn)生，從而減少胞外多糖蛋白復(fù)合物的形成，阻止SASCVs生物被膜進入成熟階段，并且通過破壞生物被膜的完整性，使抗菌藥物更易作用于細菌，從而起到抑制細菌生長的作用[7-9]。且槲皮素副作用小，無致畸、致癌、致突變等毒性作用，被廣泛應(yīng)用于臨床中[10]。但槲皮素在水和有機溶劑中幾乎不溶，且易降解，極大地限制了槲皮素生物活性的發(fā)揮[11]。鑒于此，本研究以槲皮素為中草藥，替米考星為化學(xué)合成藥，制備一種槲皮素-替米考星混合物納米粒，用于治療由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎。本試驗通過篩選槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)反應(yīng)條件，對比槲皮素-替米考星混合物納米粒和商品化替米考星溶液對SASCVs菌株的抗菌活性，評價槲皮素-替米考星混合物納米粒的優(yōu)勢以期為治療由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 SASCVs菌株由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室提供。

1.1.2 藥品與試劑 替米考星原料藥（1404001）購自武漢維物起源生物科技有限公司；替米考星標準品（K0310711）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度為91.0%；槲皮素原料藥（20111013）購自上海源葉生物科技有限公司，純度為98.5%；替米考星溶液（030142264）購自河北地邦動物保健科技有限公司；聚乙二醇6000（981007）購自天津永晟精細化工有限公司；β-環(huán)糊精（20190319）和聚乙烯醇（P8136）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器 集熱式恒溫磁力攪拌器（DF-101S）購自上海力辰邦西儀器科技有限公司；加熱磁力攪拌器（IT-07A3）購自上海滬西股份有限公司；渦旋振蕩儀（XW-80A）購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；激光納米粒度儀（ZS3600）購自丹東百特儀器有限公司；生物顯微鏡（BX41）購自O(shè)lympus公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LRH-250-S）購自上海悅豐儀器儀表有限公司；掃描電子顯微鏡（JSM-6390LV）購自NTC公司；高通量實時微生物生長儀（MicroScreen HT）購自杰靈儀器制造有限公司。

1.2 槲皮素-替米考星混合物納米粒的制備

1.2.1 最優(yōu)配方用量的篩選 稱取一定量的槲皮素（0.05、0.10、0.15和0.20 g）分別溶解于7.5% 20 mL的聚乙二醇溶液中，再稱取一定量的替米考星原料藥（0.2、0.3、0.4和0.5 g）分別加入到槲皮素-聚乙二醇混合溶液中，保證藥物含量最高，且無沉淀、變色、產(chǎn)生氣體、異物或其他變質(zhì)現(xiàn)象的槲皮素和替米考星原料藥用量為最優(yōu)用量。

1.2.2 最優(yōu)反應(yīng)條件的篩選 結(jié)合槲皮素與替米考星理化性質(zhì)，選取聚乙二醇溶液濃度（5.0%、7.5%、10.0%）、轉(zhuǎn)速（500、1 000、1 500 r/min）、反應(yīng)時間（0.5、1.0、2.0 h）、反應(yīng)溫度（25、50、75 ℃）為影響因素，設(shè)計L9（34）正交試驗（表1）。以所制備槲皮素-替米考星混合物納米粒的外觀性狀為評價指標篩選出槲皮素-替米考星混合物納米粒的最優(yōu)反應(yīng)條件。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor level table of orthogonal test

1.2.3 最優(yōu)槲皮素-替米考星混合物納米粒的制備 精確稱取1.2.1篩選出的槲皮素和替米考星原料藥的最優(yōu)用量，根據(jù)1.2.2所篩選出的最優(yōu)反應(yīng)條件，在最優(yōu)轉(zhuǎn)速下分別依次加入到20 mL最優(yōu)濃度聚乙二醇溶液中，在最優(yōu)的溫度下加熱并攪拌一定時間，最后將混合溶液通過0.45 μm的微孔濾膜，即得到最優(yōu)槲皮素-替米考星混合物納米粒。根據(jù)《中國獸藥典（2010版）》[12]中對于液體制劑的要求，觀察槲皮素-替米考星混合物納米粒的外觀性狀，包括氣味、顏色、狀態(tài)等，判斷其有無變色、發(fā)霉、產(chǎn)生氣體、異物或其他變質(zhì)現(xiàn)象。

1.3 表征

1.3.1 微觀形態(tài) 準確量取所制備的槲皮素-替米考星混合物納米粒100 μL，于光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)。并準確量取該納米粒1 mL，用蒸餾水稀釋100倍并搖勻，吸取2 μL樣品滴在帶有薄膜的銅網(wǎng)上，待其干燥后通過掃描電鏡觀察納米粒形態(tài)。

1.3.2 沉降體積比 準確量取30 mL槲皮素-替米考星混合物納米粒置于量筒中并搖勻，放置于水平面上靜置3 h，將沉降前懸浮物的液面初始高度記錄為H0，待靜置3 h后觀察沉降物部分的高度不再改變時為記為H，其沉降體積比（F）為H/H0。

1.3.3 再分散性 準確量取30 mL槲皮素-替米考星混合物納米粒于量筒中，室溫下放置1周后，以20 r/min的速度旋轉(zhuǎn)，根據(jù)量筒中的納米顆粒是否能重新均勻分散來評價槲皮素-替米考星混合物納米粒的再分散性。

1.3.4 Zeta電位和粒徑 準確量取200 μL槲皮素-替米考星混合物納米粒，用蒸餾水稀釋100倍，保存于5 mL離心管中備用，使用馬爾文納米激光粒度儀測定Zeta電位和粒徑，每次試驗重復(fù)測定3次，取平均值。

1.4 抗菌活性評價

1.4.1 SASCVs菌株生長曲線的繪制 挑取單個SASCV菌落接種于2 mL MH肉湯培養(yǎng)基中。用Micro Screen高通量實時微生物生長儀記錄細菌的濃度。以細菌濃度的對數(shù)（lg CFU/mL）的平均值為縱軸，以時間為橫軸繪制SASCVs菌株在MH肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線。

1.4.2 瓊脂擴散法測定抑菌圈 取100 μL對數(shù)生長期SASCVs菌懸液，均勻涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基表面。涂布均勻后，在每個平板上打4個孔，分別加入生理鹽水和濃度為10 μg/mL的市售替米考星溶液、替米考星標準品和槲皮素-替米考星混合物納米粒各100 μL。將瓊脂板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用游標卡尺測定并對比各劑型在瓊脂板中抑菌圈直徑的大小。

1.4.3 微量肉湯稀釋法測定MIC 采用微量肉湯稀釋法測定市售替米考星溶液、替米考星原料藥和槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的MIC。將市售替米考星溶液、替米考星標準品和槲皮素-替米考星混合物納米粒用MH肉湯倍比稀釋成終濃度為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.06 μg/mL。 將稀釋好的藥物和菌液（1×106CFU/mL）按體積比1∶1混于96孔板中，使接入96孔板中細菌終濃度為5×105CFU/mL左右。在15 min內(nèi)完成96微孔板的混菌。設(shè)置只含菌液不含藥物的陽性對照孔和只含培養(yǎng)基不含菌的陰性對照孔。設(shè)置3個平行且至少重復(fù)3次，于37 ℃普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h。并以金黃色葡萄球菌ATCC 29213、藥物環(huán)丙沙星作質(zhì)控。每次測定MIC值必須保證質(zhì)控菌的結(jié)果符合規(guī)定的質(zhì)控范圍試驗結(jié)果才有效；否則所有結(jié)果作廢[13]。

1.4.4 不同替米考星制劑對SASCVs菌株的體外殺菌曲線 配制含1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC市售替米考星溶液、替米考星原料藥和槲皮素-替米考星混合物納米粒的MH肉湯1 mL，另以空白肉湯作為生長對照。將不同濃度的含藥肉湯置于無菌細菌瓶中，分別加入1 mL對數(shù)期的SASCVs菌液，對照組做同樣處理，混勻后置于培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)。取空白對照瓶進行細菌計數(shù)，得初始細菌濃度。于0、1、2、4、8、12、18、24、48和72 h分別吸取培養(yǎng)液100 μL稀釋后進行細菌計數(shù)，計數(shù)時設(shè)置3個平行取平均值。得到各時間點不同濃度存活菌落數(shù)后，取此對數(shù)值為縱軸，時間點為橫軸繪制殺菌曲線，分析市售替米考星溶液、替米考星原料藥和槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的殺菌作用。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，比較替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液抑菌活性的差異顯著性，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)配方和條件篩選

以外觀性狀為評價指標，當替米考星為0.4 g、槲皮素為0.1 g、溶劑為20 mL 7.5%的聚乙二醇溶液，在轉(zhuǎn)速為1 000 r/min、反應(yīng)時間為1 h、反應(yīng)溫度為50 ℃時，所制備的槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)，其顏色清亮，無沉淀和絮狀物，且無發(fā)霉、變色、產(chǎn)生氣體等其他變質(zhì)現(xiàn)象（圖1）。

圖1 槲皮素-替米考星混合物納米粒的外觀性狀Fig.1 Appearance properties of quercetin-tilmicosin mixture nanoparticles

2.2 表征

2.2.1 微觀形態(tài) 光學(xué)顯微鏡下最優(yōu)配方的槲皮素-替米考星混合物納米粒分布均勻，顆粒大小一致（圖2A）；掃描電鏡下最優(yōu)配方的槲皮素-替米考星混合物納米粒顆粒大小均一，分布均勻，表面光滑平整（圖2B）。

A，光鏡下圖像（800×）;B，SEM圖像（10 000×）A，Light microscope image （800×）;B，SEM images（10 000×）圖2 槲皮素-替米考星混合物納米粒微觀形態(tài)Fig.2 Microscopic morphology of quercetin-tilmicosin polymer nanoparticles

2.2.2 沉降體積比 所制備槲皮素-替米考星混合物納米粒的F 值為1，表明該納米粒穩(wěn)定性高。

2.2.3 再分散性 量筒下部的槲皮素-替米考星混合物納米粒能夠很快地重新均勻分散且流動性良好，表明該納米粒不易凝集，再分散性良好。

2.2.4 Zeta電位和粒徑 所制備最優(yōu)配方的槲皮素-替米考星混合物納米粒Zeta 電位為-7.69 mV（圖3A），粒徑為741.9 nm（圖3B）。

圖3 槲皮素-替米考星混合物納米粒Zeta電位（A）和粒徑（B）Fig.3 Zeta potential （A） and particle size （B） of quercetin-tilmicosin polymer nanoparticles

2.3 抗菌活性評價

2.3.1 SASCVs菌株生長曲線 SASCVs菌株在MH肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線如圖4所示。在1～3 h時，細菌生長緩慢，處于遲緩期；在4～24 h時，細菌生長迅速，細菌數(shù)目以幾何級數(shù)增加，處于對數(shù)生長期。 在25～28 h時，細菌生長數(shù)與死亡數(shù)幾乎相等，活菌數(shù)目不增不減，處于穩(wěn)定期。 在29～48 h，死亡細菌數(shù)目逐漸上升，活菌數(shù)減少，處于衰亡期。

圖4 SASCVs菌株在MH肉湯中的生長曲線（n=3）Fig.4 Growth curve of SASCVs strain in MH broth （n=3）

2.3.2 瓊脂擴散法測定抑菌活性 替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液的抑菌圈直徑分別為（2.54±0.51）、（1.51±0.23）和（1.38±0.17）cm，槲皮素-替米考星混合物納米粒的抑菌區(qū)域比相同濃度的市售替米考星溶液略大，小于替米考星標準品，但三者之間差異均不顯著（P>0.05）。

2.3.3 微量肉湯稀釋法測定抑菌活性 替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液對SASCVs菌株的MIC分別為1、1和2 μg/mL。由此可見，替米考星標準品和槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的MIC相等，且小于市售替米考星溶液對SASCVs菌株的MIC，但三者之間差異均不顯著（P>0.05）。

2.3.4 體外殺菌曲線 替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液對SASCVs菌株的體外殺菌曲線如圖5所示。結(jié)果表明，替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液對SASCVs菌株均具有較強的殺菌能力，且3種藥物均隨濃度的增加，對SASCVs菌株的殺菌效果隨之增加。當替米考星標準品為2MIC時（4 μg/mL）、槲皮素-替米考星混合物納米粒為1MIC（1 μg/mL）和市售替米考星為1MIC（1 μg/mL）時，均已經(jīng)表現(xiàn)出殺菌作用。

圖5 替米考星標準品（A）、市售替米考星溶液（B）和槲皮素-替米考星混合物納米粒（C）對SASCVs菌株的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of tilmicosin standard （A）,commercial tilmicosin solution （B） and quercetin-tilmicosin polymer nanoparticles （C） against SASCVs strain

3 討 論

奶牛乳腺炎給奶牛業(yè)帶來了巨大損失，由于SASCVs菌株可在機體內(nèi)持續(xù)存在，會引起奶牛持續(xù)性和反復(fù)性感染乳腺炎[14-16]。雖然替米考星對金黃色葡萄球菌的MIC值較低，具有較強的抗菌活性，但SASCVs菌株表面易形成生物被膜，常規(guī)抗菌藥物劑型難以穿透生物被膜直接作用于SASCVs菌株，常引起奶牛乳腺炎治療失敗[17-19]。槲皮素通過阻止SASCVs生物被膜進入成熟階段，破壞生物被膜的完整性，使抗菌藥物更易作用于細菌，從而起到抑制細菌生長的作用，被廣泛應(yīng)用于臨床中[20-21]。當槲皮素-替米考星混合物納米粒作用于SASCVs生物被膜，槲皮素會破壞SASCVs生物被膜的完整性，可有助于替米考星穿透生物被膜，直接作用于SASCVs菌株，從而起到殺菌作用。故本研究以槲皮素為中草藥，替米考星為化學(xué)合成藥，制備一種適用于治療由SASCVs菌株引起奶牛乳腺炎的槲皮素-替米考星混合物納米粒。

本試驗以外觀性狀篩選槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)配方，發(fā)現(xiàn)槲皮素的溶解性較差，與文獻報道一致[22-23]。當替米考星為0.4 g、槲皮素為0.1 g、溶劑為20 mL 7.5%的聚乙二醇溶液，在轉(zhuǎn)速為1 000 r/min、反應(yīng)時間為1 h、反應(yīng)溫度為50 ℃時，可獲得槲皮素-替米考星混合物納米粒最優(yōu)配方。其外觀形性狀符合《中國獸藥典（2010版）》[12]中對于液體制劑的要求。光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下的槲皮素-替米考星混合物納米粒分布均勻，顆粒大小一致；根據(jù)《中國獸藥典（2010版）》[12]規(guī)定沉降體積比F值不得低于0.9。F值越大，表示沉降物的高度越接近納米粒的原始高度，納米粒就越穩(wěn)定[12]。本研究所制備槲皮素與替米考星混合物納米粒的F值為1，表明該納米粒穩(wěn)定性高[24]。且該納米粒能夠很快地重新均勻分散且流動性良好，表明該納米粒不易凝集，再分散性良好[25]；該納米粒平均粒徑為741.9 nm，與其他文獻報道的替米考星納米粒[26-28]相比，粒徑偏大；Zeta電位為-7.69 mV，有利于該混合物納米粒制劑通過靜電作用與SASCVs生物被膜表面正電荷相作用，并吸附于生物被膜表面，從而更有利于該納米粒破壞SASCVs生物被膜的完整性，促進替米考星穿透生物被膜，直接作用于SASCVs菌株[29]。因此，本試驗所研制的槲皮素-替米考星混合物納米粒符合納米粒的制備要求。

肉湯培養(yǎng)基中，SASCVs菌株在1～3 h處于遲緩期，4～24 h處于對數(shù)期，25～28 h處于穩(wěn)定期，29～48 h處于衰亡期，符合常規(guī)細菌生長規(guī)律[30]。3種不同制劑的抑菌圈直徑大小表現(xiàn)為替米考星標準品>槲皮素-替米考星混合物納米粒>市售替米考星溶液。由此可見，槲皮素-替米考星混合物納米粒的抑菌區(qū)域比相同濃度的市售替米考星溶液略大，但小于替米考星標準品。此結(jié)果可能是由于槲皮素的加入，使納米粒的抑菌圈直徑大于市售替米考星溶液。但是又由于在瓊脂培養(yǎng)基中，納米粒擴散較差，故納米粒的抑菌圈直徑小于替米考星標準品[31]。且微量肉湯稀釋法測定MIC值發(fā)現(xiàn)，替米考星標準品和槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的MIC相等，且小于市售替米考星溶液對SASCVs菌株的MIC值，表明槲皮素-替米考星混合物納米粒和替米考星標準品具有相同的殺菌活性，且強于市售替米考星溶液。當藥物濃度為4、8和16MIC時，8 h內(nèi)殺菌速度和程度仍然相應(yīng)增加，即為濃度依賴性的藥物[32-33]。所以，由體外殺菌曲線可知，替米考星標準品、槲皮素-替米考星混合物納米粒和市售替米考星溶液對SASCVs菌株的殺菌能力呈現(xiàn)出濃度依賴性，即替米考星濃度越大，對SASCVs菌株的殺菌效果就越強。且根據(jù)殺菌速率和程度，發(fā)現(xiàn)槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株的殺菌能力略大于替米考星標準品，明顯大于市售替米考星溶液。

4 結(jié) 論

本研究所制備的槲皮素-替米考星混合物納米粒對SASCVs菌株具有較強的殺菌能力，可為治療由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供基礎(chǔ)研究資料。