Mago nashi、Y14 蛋白復(fù)合物參與生殖和細胞調(diào)控的研究進展

王曉楠

（安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230000）

0 引言

Mago nashi ( 日語，意思是沒有子孫，簡稱mago) 基因最早是Boswell[1]等在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster, D.melanogaster) 中發(fā)現(xiàn)的一種母體效應(yīng)基因(Maternal genes)，即在母體卵發(fā)生過程表達，在成熟的卵母細胞作用或者是對成熟的卵母細胞作用。該類基因不影響母體本身，但是產(chǎn)生后代所必需的。之后，人們從諸如模式生物秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans, C.elegans)[2]、低等真核生物斑馬魚[3]、以及高等哺乳動物人[4]和血吸蟲[5]等多細胞生物中也發(fā)現(xiàn)了mago 基因。

Y14 基因在2000 年間由多家實驗室?guī)缀跬瑫r報道，由于他們使用的實驗材料和命名原則不同，在名稱上存在一定的差異。Zhao[4,6]等利用酵母雙雜交從人腦胚胎cDNA 文庫中分離出一個655bp 的cDNA 片段，是編碼黑腹果蠅mago基因的人類同源物，即 MAGOH。利用人MAGOH 作為誘餌蛋白，獲得了4 個獨立的cDNA 克隆，它們編碼了一個含有保守RNA 結(jié)合區(qū)不同長度的新蛋白，因蛋白結(jié)構(gòu)中含有一個RNA 識別模序8，所以命名為RBM8 (RNA binding motif protein 8)。Kataoka[7]等以Hela 細胞為材料，用缺少氨基末端的RanBP5 蛋白篩選到17 個陽性克隆，其中14 個克隆與一個假想的RNA 結(jié)合蛋白相似，因此命名為Y14。Mohr[8]等以果蠅的mago 融合蛋白為誘餌，用酵母雙雜交方法獲取了一個與mago 相互作用的未知基因，因此根據(jù)性質(zhì)將其命名為Tsunagi(tsu，日語，意思是連接或結(jié)合)。命名上的多樣性說明大家對這個蛋白的認(rèn)識還未統(tǒng)一，但這幾家實驗室所得到的結(jié)果具有很大的相似性，即蛋白序列中含有一個進化中高度保守的RNA 結(jié)合域(RNA binding domain, RBD)，與核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP) 家族的RNA 結(jié)合蛋白相似。在體內(nèi)和體外實驗中，它們形成復(fù)合物共同發(fā)揮生物學(xué)作用，參與多種細胞活動過程。

1 Mago nashi 和Y14 蛋白的結(jié)構(gòu)特點

Mago 和Y14 蛋白在進化中高度保守，其同系物從高等哺乳動物人到低等的真核生物中都保守表達。果蠅特異性表達的mago 蛋白與線蟲的同系物有80%的同源性[2]，與人的mago 蛋白有88%的同源性[3]。果蠅的Tsunagi 蛋白與人的RBM8 具有63%的同源性和72%的相似性[6]。Kataoka[7]等利用RBM8 篩選爪蟾卵母細胞cDNA 文庫，發(fā)現(xiàn)RBM8 的爪蟾同源蛋白Xe-Y14，并在線蟲、鼠、酵母細胞中找到同源蛋白。序列分析表明mago 蛋白中缺乏已知的結(jié)構(gòu)模序，但氨基酸測序發(fā)現(xiàn)，Y14 的N 端富含Arg 和Lys，C 端同樣富含堿性氨基酸殘基，2 個Arg-Ser 二肽重復(fù)序列顯示Y14 屬于SR 蛋白家族。

Y14 蛋白中還包含一個保守的RBD，又稱為RNA 識別模序 (RNA recognition motif, RRM)，RRM 模序中有兩個高度保守的核糖核蛋白結(jié)合模序，分別為RNP1 和RNP2，兩個模序間隔25～35 個氨基酸殘基。RRM 中有兩個蛋白相互作用的平面已經(jīng)證實，一個是位于兩個α-莖環(huán)之間的口袋，這個結(jié)構(gòu)在很多蛋白中廣泛存在，與pre-RNA 剪接，DNA 互補配對，信號傳導(dǎo)等細胞過程有關(guān)。另一個是β-片層平面，用來介導(dǎo)Y14 與mago 蛋白相結(jié)合[9-11]。采用酵母雙雜交、pull-down和免疫共沉淀等方法，已證明在體內(nèi)與體外，mago 和Y14 之間存在相互作用，形成異二聚體復(fù)合物[12]。有研究者分別轉(zhuǎn)染Y14 dsRNA 和mago dsRNA 后，用Western Blotting 分 析SL2 細胞內(nèi)蛋白表達水平。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染mago dsRNA 后的4-6 天，mago 蛋白表達水平下降了5-10%，Y14 蛋白表達也稍有下降。相反，當(dāng)轉(zhuǎn)染Y14 dsRNA 時，mago 蛋白表達也會下降。這也支持了mago/Y14 是聚合物的觀點，還提示聚合物中的一種亞單位的表達水平受抑制時，會影響另一個成分的表達[13]。

2 Mago nashi 和Y14 蛋白的功能研究

隨著mago 和Y14 蛋白的研究不斷深入，它們的功能也越來越清楚，包括參與生殖和發(fā)育的調(diào)節(jié)，mRNA 剪接和定位，以及NMD 等細胞活動過程。

2.1 Mago nashi 和Y14 參與生殖和發(fā)育的調(diào)節(jié)

Mago nashi 基因在果蠅生殖系細胞發(fā)育過程中，起到兩方面的作用，一是濾泡細胞后極的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要mago 基因編碼蛋白的參與，其次在該基因功能受損時，生物體表現(xiàn)為泛雄性化[14]。Boswell[1]等取自野生型果蠅胚胎的mago 物質(zhì)注射到在早期發(fā)育中存在缺陷的突變型胚胎中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎腹部角質(zhì)層的缺陷可以緩解，由于突變導(dǎo)致了存在于野生型胚胎中的mago 物質(zhì)不足，可見mago 是胚胎形成正常的腹部所必需的。他們還發(fā)現(xiàn)突變體中少數(shù)可以存活的子代體內(nèi)異染顆粒減少甚至消失，生殖細胞不能生成。Newmark 等[14]分析mago 突變體的表型變化，發(fā)現(xiàn)果蠅卵子發(fā)生時mago 功能缺失將導(dǎo)致后卵泡細胞至卵母細胞的信號傳導(dǎo)受抑制，卵母細胞的前后和背腹軸無法建立，最終導(dǎo)致生殖細胞無法形成。

Lewandowski[15]等解剖0-1 天雌性果蠅卵巢，利用Ranshi蛋白抗體進行免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)在含有GFP-Mago 的免疫沉淀中檢測到Ranshi 和Tsu/Y14，但在缺乏GFP-Mago 或表達nlsGFP 的卵巢提取物中未檢測到相關(guān)蛋白，這表明含有Mago、Tsu/Y14 和Ranshi 形成的復(fù)合物是果蠅胚胎正常發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)。

Hir[13]用 雙 鏈RNAi(double-stranded RNAi，dsRNAi) 敲除SL2 細胞內(nèi)源性的mago 和Y14 蛋白，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染dsRNA后的第四天細胞生長受到抑制，提示mago 和Y14 蛋白缺失可以抑制細胞生長。Kawano[16]等將在C.elegans 中表達的Y14 基因的雙鏈RNA 轉(zhuǎn)入帶有質(zhì)粒L4440 的大腸埃希氏菌HT115 中，以飼喂法導(dǎo)入L4 期幼蟲體內(nèi)產(chǎn)生RNAi，發(fā)現(xiàn)Y14基因表達被干擾后，90%蟲體后代發(fā)育受到抑制：胚胎伸長受限制，部分蟲體雖能夠孵化但發(fā)育至幼蟲的L1 期就停止發(fā)育。這表明被抑制的Y14 基因在蟲體繁殖中發(fā)揮了作用。并且，用浸泡法進一步將Y14 RNA 導(dǎo)入野生型胚胎中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育至晚期幼蟲時生殖腺內(nèi)無卵母細胞，而是充滿大量精子，為異常的泛雄性化的表現(xiàn)，使得正常的精子-卵母細胞之間的轉(zhuǎn)換發(fā)生障礙。Y14 基因RNAi 后子代和胚胎的表型變化提示Y14 基因的表達與后期胚胎發(fā)生和成蟲性別轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。干擾線蟲mago 基因表達，同樣可抑制胚胎后期的性別轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)[17]，暗示 mago 和Y14 在線蟲胚胎發(fā)育中有同等重要的作用，表明它們的功能在真核細胞中具有高度保守性。

在秀麗隱桿線蟲胚胎中，生殖細胞系是通過連續(xù)的不對稱細胞分裂而建立的，每個細胞分裂產(chǎn)生一個體細胞和一個生殖細胞系子細胞。PIE-1 是一種必需的母體因子，在胚胎生殖細胞中富集，是生殖細胞正常發(fā)育所必需的。Gauvin[18]等 通 過RNAi 篩 選，確 定Y14 和mag1 ( 即 果 蠅 tsunagi 和mago nashi) 是胚胎PIE-1::GFP 水平的調(diào)節(jié)因子，并且發(fā)現(xiàn)Y14 和mag1 在早期胚胎中不調(diào)控 PIE-1 的降解、分離或合成，但調(diào)控母體中 PIE-1::GFP 的濃度?？梢?，該復(fù)合物在調(diào)節(jié)母體生殖細胞發(fā)育中起著重要作用。Park[19]等使用RNA干擾(RNAi) 方法研究了AtMago 基因在擬南芥中表達下調(diào)后，植物的總體發(fā)育被推遲，表現(xiàn)在尺寸上變小、莖和根分生組織、花粉和胚胎發(fā)育方面都存在缺陷，還出現(xiàn)了無法存活的種子。在RNAi-AtMago 植物中，這種明顯呈現(xiàn)出的廣泛細胞空泡化、細胞壁異常定位和細胞死亡等缺陷提示Mago蛋白缺失是導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩和胚胎活力降低的原因。用RNAi 方法抑制日本血吸蟲Mgao nashi 基因表達，血吸蟲表現(xiàn)出泛雄性化[20,21]。

雖然Mago 和Y14 在發(fā)育過程中具有相似的特征和功能，但它們的表型并不完全相同。在果蠅卵發(fā)生的S9-S10 過程中，純合的Y14 突變卵母細胞中轉(zhuǎn)化生長因子-促細胞瘤樣蛋白(TGF inhibitor /Gurken)和TGF 促細胞瘤(TGF inhibitor) mRNA 經(jīng)常減少或檢測不到[8]。提示這兩種蛋白可能在某些發(fā)育過程中獨立發(fā)揮作用。Parma[22]等使用mago 和tsu 的空等位基因生成生殖細胞系克隆,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，mago 功能缺失時，種系干細胞可以分裂但不能分化。mago 缺失的種系干細胞在至少11 天的時間內(nèi)產(chǎn)生克隆，這表明mago 對干細胞自我更新來說不是必需的。然而，缺乏tsu/Y14 功能的種系干細胞與野生型無法區(qū)分。此外，tsu/Y14 缺失的早期胚胎中，卵母細胞無法集中于單個細胞?？梢姡粌Hmago 是種系干細胞分化所必需的，mago 在這個過程中獨立于tsu/Y14 發(fā)揮作用。另一方面，tsu/Y14 可能與mago 共同發(fā)揮作用，將卵母細胞的發(fā)育控制在單個細胞中。

不同于果蠅和線蟲的是，人類的MAGOH 和RBM8 基因不僅僅局限于胚胎組織，而是在人體組織中廣泛表達，其蛋白表達水平與細胞增殖有關(guān)：當(dāng)細胞增殖時，表達量增高；細胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時，表達量降低[4,6]。免疫染色實驗顯示MAGOH 和RBM8 蛋白除了在細胞核外還在中心體中共定位[23]。Rosenfeld[24]等發(fā)現(xiàn)MAGOH 調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生過程中相關(guān)蛋白Lis1 的水平，突變可導(dǎo)致小頭癥和腦體積減小。MAGOH 的異二聚體復(fù)合物Y14 染色體區(qū)域的畸變也常與智力殘疾和大腦畸形有關(guān)。因此推斷，MAGOH 和Y14 的生理表達水平可能是正常大腦發(fā)育所必需的。通過環(huán)己酰亞胺追蹤實驗發(fā)現(xiàn)外源性的Magoh 和Y14 的蛋白降解速度比野生型快，野生型Y14 在細胞中非常穩(wěn)定，這表明Magoh 和Y14 蛋白復(fù)合物的異二聚體結(jié)構(gòu)對維持蛋白的穩(wěn)定性至關(guān)重要[25]。

2.2 Mago nashi 和Y14 參與mRNA 剪接和定位

真核生物基因表達的mRNA 出核轉(zhuǎn)運、mRNA 前體剪接和mRNA 降解等步驟是相偶聯(lián)的。在研究介導(dǎo)mRNA 出核轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白時發(fā)現(xiàn)，一些蛋白復(fù)合物同時在基因轉(zhuǎn)錄、mRNA 前體剪接、出核轉(zhuǎn)運及其下游步驟中出現(xiàn)，Mago nashi和Y14 蛋白就是如此。

Kataoka 等[7]利用熒光標(biāo)記的抗Y14 抗體4C4，顯示Y14 主要存在于細胞核內(nèi)的核小點(nuclear speckle domain)處，提示Y14 可能和剪接有關(guān)。用4C4 在體外有效地與腺病毒晚期啟動子Ad2 mRNA 剪接后復(fù)合物、雞d- 晶體蛋白(crystalline)mRNA 剪接后復(fù)合物免疫沉淀，但不能與二氫葉酸還原酶(DHFR) mRNA(不含內(nèi)含子的DHFR mRNA)免疫沉淀，證實Y14 參與mRNA 剪接過程，而且與mRNA 剪接后產(chǎn)物有效地結(jié)合。將RNA 微注射入爪蟾卵母細胞的實驗結(jié)果提示，體內(nèi)情況亦然?？梢奩14 在 mRNA 剪接過程發(fā)揮重要作用。

Hir[13]等 將 高 鐵 紅 蛋 白（β-globin）pre-mRNA 與 重 組GST-MGN/Y14 或GST 以及上述對照RNA 的混合物一起注入果蠅卵母細胞核。孵育2 小時后，解剖卵母細胞，檢測抗GST 抗體對胞核內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi)β-globin mRNAs 免疫共沉淀的效果。結(jié)果顯示，注射入MGN/Y14 復(fù)合物后，抗體與剪切的RNA 特異性共沉淀，對照組則沒有與RNA 結(jié)合。此外，抗體與MGN/Y14 復(fù)合物在胞核內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi)的結(jié)合能力沒有變化，卵母細胞中也沒有檢測到大量游離的內(nèi)源性Y14。由此可見，MGN 與Y14 以復(fù)合物的形式參與mRNA 剪接，并伴隨mRNA 共同輸出至細胞質(zhì)。

Hachet 等[26]將oskar 基因組中的i1，i2 和i3 三個內(nèi)含子刪除，構(gòu)建無內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因oskΔi(1,2,3) 并觀察其定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在卵子發(fā)生早期，oskΔi(1,2,3) mRNA 可以無誤地從滋養(yǎng)細胞運輸至卵母細胞；當(dāng)發(fā)育至卵子發(fā)生中期時，oskΔi(1,2,3) mRNA 即發(fā)生錯誤定位，表現(xiàn)為oskΔi(1,2,3) mRNA 變得彌散開來，分布遍及整個卵母細胞胞質(zhì)，而對照組的osk mRNA 則集中在卵母細胞后極。如果oskar 被過量表達或被錯誤定位,它將引發(fā)生殖細胞在異位形成。提示oskar mRNA 剪接和其胞質(zhì)定位緊密聯(lián)系，oskar mRNA 剪接可以調(diào)節(jié)mRNA 核蛋白復(fù)合物的裝配和組成，以利于oskar RNA 在胞質(zhì)正確定位。

Tsunagi 基因突變的果蠅中，oskar mRNA 可以正確定位在卵母細胞前極，但卵室內(nèi)的oskar mRNA 則不能在后極定位，相反，野生型果蠅的oskar mRNA 則可以集中并正確定位在卵室后極，可見Tsunagi 蛋白是oskar mRNA 集中并在卵母細胞后極定位必需的。Mago 基因突變的果蠅中，oskar mRNA蓄積在卵母細胞，也不能在卵室后極定位[8]。由此可見，Mago和Y14 與mRNA 的剪接和胞質(zhì)定位緊密聯(lián)系，一旦其功能缺失，mRNA 就不能正常剪接和定位。

2.3 Mago nashi 和Y14 參與無意義介導(dǎo)的mRNA 降解

無意義介導(dǎo)的mRNA 降解(NMD)是真核生物mRNA 監(jiān)測途徑，降解含有過早終止密碼子(PTCs)的缺陷mRNA。該現(xiàn)象最早是Peltz[27]提出的一種細胞內(nèi)重要的mRNA 監(jiān)視機制，被認(rèn)為在幾乎所有的真核細胞中都發(fā)揮功能，廣泛存在于人體、哺乳動物及真核生物如果蠅、線蟲等等，并被認(rèn)為是進化中高度保守的[28-32]。

NMD 途徑通過監(jiān)視轉(zhuǎn)錄過程，將異常mRNA 與正常mRNA 區(qū)分開來，并將異常mRNA 迅速降解，及時阻止了對細胞具有潛在危害的截短蛋白的產(chǎn)生，它不僅能夠發(fā)現(xiàn)和摧毀異常mRNA，而且在調(diào)節(jié)mRNA 壽命和控制基因活性的過程中起到十分重要的作用。這種mRNA 質(zhì)量控制機制，可降解含有過早終止密碼子(PTCs)的轉(zhuǎn)錄本，以保護細胞免受截短蛋白的有害影響[33]。

NMD 途徑中有兩個重要的功能單位，一個是外顯子-外顯子連接點復(fù)合物(exon-exon junction complex, EJC)，一個是由人類上游移碼突變體(human up-frameshift mutant, hUpf)蛋白組成的監(jiān)視復(fù)合體。

EJC 是細胞選擇特定mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)的主要機制，在哺乳動物細胞中調(diào)控NMD、核mRNA 輸出和翻譯。EJC的核心是一個異四聚體，由Mago、Tsu/Y14、真核起始因子4AIII (eIF4AIII) 和Barentsz/MLN51 組成。晶體結(jié)構(gòu)表明，eIF4AIII 與靶mRNA 結(jié)合，而MAGOH/Y14 異源二聚體通過抑制eIF4AIII 的ATP 酶活性來調(diào)控eIF4AIII[34,35]。由于premRNA 的剪接，EJC 蛋白復(fù)合物沉積在剪接體內(nèi)含子上游20-24 核苷酸處，并被翻譯的核糖體所取代。它由一個內(nèi)層異四聚體核心(由eIF4A3、Btz、Y14 和Mago nashi 組成)組成，作為Upf3、Upf2 等蛋白的外殼結(jié)合平臺，并穩(wěn)定地結(jié)合直至成熟的mRNA 核蛋白顆粒(messenger ribonucleoprotein particle, mRNP) 輸出至胞質(zhì)，包括核輸出、穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運、無意義介導(dǎo)的衰變和翻譯。在這過程中，Y14 是NMD 所必需的蛋白質(zhì)，它的作用是補充hUpf 蛋白到EJC 上，從而觸發(fā)NMD[36]。但是，目前EJC 模型被提出來只用來解釋哺乳動物的NMD，因為其他生物體要么缺少EJC(如酵母)，要么它們的EJC 蛋白不是NMD 所必需的(如秀麗隱桿線蟲)[37]。

近年來，隨著分子生物學(xué)的進展，人體發(fā)現(xiàn)NMD 與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著十分密切的關(guān)系。有報道稱，果蠅mago 和Y14 等EJC 蛋白，以及Srp54 剪接因子，在敏化條件下是Hedgehog (Hh)通路活性的修飾因子。Hh 分子是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)配體，在動物的發(fā)育過程中控制細胞命運、增殖與分化。如果該信號通路表達異常，會引起腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。mago 抑制可以改變Cubitus interruptus (Ci)的剪接模式來降低ci-155 轉(zhuǎn)錄因子水平，從而降低Hh 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性[38]。Salicioni[39]等發(fā)現(xiàn)人類RBM8 與候選腫瘤抑制因子OVCA1存在相互作用，RBM8 在人體廣泛表達，尤其在睪丸、心臟、胎盤、脾臟、胸腺和淋巴細胞中等部位高水平表達，提示RBM8在控制腫瘤命運中起重要作用。腫瘤發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境壓力，包括缺氧、氨基酸缺乏、其他營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、血管系統(tǒng)不足等都可激活以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為中心的未折疊反應(yīng)蛋白 (UPR)的表達水平[40]。無害的低水平壓力不足以觸發(fā)UPR，在組織培養(yǎng)細胞或小鼠中，UPF 缺失降低了UPR 激活閾值，延長了UPR 應(yīng)答，說明NMD 正常情況下抑制了UPR。但是，如果所遇到的壓力超過了細胞能夠承受的閾值，就必須通過凋亡來終止， NMD 就發(fā)揮了作用[41]。Viswanathan[42]等發(fā)現(xiàn)MAGOH 降低會導(dǎo)致剪切過程中的內(nèi)含子保留增加，RNA 監(jiān)測異常，損害細胞的正常活力，從而引發(fā)凋亡或細胞死亡。因此，當(dāng)細胞凋亡被觸發(fā)時，NMD 被減弱，增加了細胞死亡的速率和穩(wěn)健性，引起腫瘤發(fā)生。

3 展望

分子進化原理告訴我們：一個功能區(qū)間常常由于純化選擇(purifying selection)的存在而表現(xiàn)出序列上的保守性，其功能越重要，序列越保守?；虼夭粌H享有共同的進化過程，而且保持了共同的一般功能，因其重要的生物功能而在自然選擇的作用下呈高度的保守性[43]。如鼠類和蠅類蛋白平行進化同源性的存在幾乎都依賴它們的同源結(jié)構(gòu)域，這加強了這些功能域決定其特性的觀點。線蟲和果蠅在生殖過程中的相似性表明配子發(fā)生的許多方面都是保守的，這一基本的生物學(xué)過程也存在于其他多細胞動物中。

從以上綜述可以看出，mago 和Y14 蛋白在各物種間保守表達，可見其功能非常重要?，F(xiàn)有的研究結(jié)果使我們對mago和Y14 參與生殖發(fā)育調(diào)節(jié)和細胞調(diào)控尤其在NMD 中的重要作用有了初步的了解。隨著各種功能基因組學(xué)研究方法的不斷創(chuàng)新及運用，mago 和Y14 蛋白的功能將研究得更加透徹，以進一步揭示NMD 途徑的功能和調(diào)控機制，并將闡明它們在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用，為我們在基因翻譯水平上研究正常細胞和腫瘤細胞、并且有可能為腫瘤的基因治療甚至戰(zhàn)勝腫瘤提供新的方法和思路。