慢性情緒應(yīng)激對急性心肌梗死后骨髓c-kit+干細(xì)胞動員的影響

王超，杜泓森，侯季秋，燕莎莎，王昀，趙海濱

焦慮、抑郁等慢性情緒應(yīng)激作為常見的精神心理疾病，已成為影響生活質(zhì)量的首要病因。作為冠心病發(fā)生、發(fā)展的獨立危險因素，焦慮、抑郁在冠心病患者中的發(fā)病率約30%，合并焦慮、抑郁的冠心病患者重度心力衰竭、惡性心律失常等并發(fā)癥的發(fā)生率明顯高于非焦慮、抑郁人群[1]。研究顯示，急性心肌梗死發(fā)生后，壞死的心肌誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)激活可能是連接慢性情緒應(yīng)激與心肌梗死病理進(jìn)程的關(guān)鍵途徑。炎癥反應(yīng)可動員骨髓c-kit+干細(xì)胞釋放入血并遷移至梗死部位發(fā)揮心肌修復(fù)的作用，但過于劇烈的炎癥反應(yīng)則可抑制骨髓c-kit+干細(xì)胞動員并促進(jìn)其凋亡[2-5]。那么焦慮、抑郁等慢性情緒應(yīng)激是否可放大心肌梗死后的炎癥反應(yīng)？雙重因素導(dǎo)致的炎癥狀態(tài)對骨髓c-kit+干細(xì)胞的動員有何影響？核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路作為炎癥反應(yīng)的起始環(huán)節(jié)，在其中是否發(fā)揮作用？本文研究了慢性情緒應(yīng)激對心肌梗死后骨髓c-kit+干細(xì)胞動員的干預(yù)效應(yīng)，并初步探討了與NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的可能相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

研究資料：健康SPF級雄性SD大鼠，體重170～190 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房。實驗試劑及儀器：c-kit+-PE、c-kit+-APC流式抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），NF-κB 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），小動物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司），小動物超聲影像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司），全自動三導(dǎo)聯(lián)心電圖（美國BD公司）。

建模方法及分組：本研究采用兩種慢性情緒應(yīng)激方案，分別建立焦慮和抑郁的慢性情緒應(yīng)激模型，并與冠狀動脈左前降支結(jié)扎建立心肌梗死模型相結(jié)合，分別建立心肌梗死合并焦慮、心肌梗死合并抑郁的大鼠模型。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將動物分為假手術(shù)組、心肌梗死組、心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組，每組6只。

心肌梗死模型建立：大鼠經(jīng)1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，經(jīng)口連接氣管插管后接小動物呼吸機(jī)。于左側(cè)肋骨第三、四肋間打開胸腔，用5-0帶線縫合針結(jié)扎左側(cè)心耳下2 mm部位。術(shù)后腹腔注射0.2 ml利多卡因以防止心律失常，40萬單位青霉素預(yù)防術(shù)后感染。以術(shù)后第二天心電圖Ⅰ、aVL、V1～V6導(dǎo)聯(lián)中有6個以上導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)病理性Q波為心肌梗死成功標(biāo)志。假手術(shù)組穿線后打松結(jié)，其余步驟相同。

不確定空瓶刺激法建立焦慮模型：參照文獻(xiàn)[6]，建模周期共21天，建模期間大鼠自由飲食。第1～7天每天9:00～9:10和21:00-21:10早晚分兩次給予飲水，其余時間禁水讓大鼠處于口渴狀態(tài)。第8～21天每日早晚隨機(jī)一個時間段給予空瓶，另一個時間段喂水。

孤養(yǎng)+慢性不可預(yù)知性應(yīng)激建立抑郁模型：參照文獻(xiàn)[7]，建模周期共21天。建模期間每只大鼠單籠飼養(yǎng)，同時禁食、禁水、夾尾巴、晝夜顛倒、潮濕墊料、鼠籠傾斜、束縛七種刺激每天隨機(jī)選擇一種進(jìn)行刺激，每種刺激共進(jìn)行3次。

于慢性情緒應(yīng)激建模的第15天對大鼠實施心肌梗死手術(shù)，建模第22天對動物進(jìn)行超聲心動圖檢查及行為學(xué)測試后處死動物，取外周動脈血、心臟以及大腦。

超聲心動圖檢測：大鼠經(jīng)1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，仰臥固定，左胸前備皮，取左心室短軸切面，探測M型曲線，每只鼠取3個連續(xù)心動周期，記錄大鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）、左心室收縮末期容積（LVESV）和左心室舒張末期容積（LVEDV）。

曠野試驗（OFT）：試驗裝置為100 cm×100 cm×40 cm的木制箱，底板有25個方格（20 cm×20 cm），正上方2 m處有一個攝像系統(tǒng)，其視野可覆蓋整個曠場內(nèi)部。將大鼠放在中央格后，開始計時并攝像，共計3 min。記錄大鼠在曠場箱內(nèi)水平運動得分（每越過一個格子記1分）以評價大鼠的水平運動能力，記錄大鼠垂直運動得分（每直立一次記1分）以評價大鼠的垂直運動能力。

高架十字迷宮（EPM）：試驗裝置由兩條相對開放臂（50 cm×10 cm）和兩條相對閉合臂（50 cm×50 cm×10 cm）及中央?yún)^(qū)（10 cm×10 cm）連接而成，距離地面50 cm。將大鼠從中央格面向開放臂放入，記錄5 min內(nèi)的活動情況。記錄大鼠在開放臂停留的時間（OE），進(jìn)入開放臂的次數(shù)（OT），在閉合臂停留的時間（CE），進(jìn)入閉合臂的次數(shù)（CT）以評價動物焦慮程度，計算 OE/（OE+CE）以及 OT/（OT+CT）的比值。

強迫游泳（FST）：試驗裝置為一個直徑20 cm、高46 cm的圓形透明有機(jī)玻璃筒，水深20 cm左右以大鼠掙扎過程中后爪剛好離開桶底為宜，水溫24℃左右。將大鼠放入游泳池中，使其自由游泳6 min，記錄大鼠在后四分鐘內(nèi)漂浮在水面不動的時間。

HE染色及Masson染色：大鼠麻醉后，打開胸腔，自左心室插入灌流器用10%中性福爾馬林溶液灌注固定，摘取心臟和大腦浸泡于10%中性福爾馬林溶液48 h后制備石蠟切片，心臟切片行Masson染色及HE染色，大腦切片行HE染色。

ELISA法檢測外周血NF-κB含量：參照文獻(xiàn)[8]，大鼠麻醉后，腹主動脈采血置于含促凝劑的采血管中，靜置30 min，600 g離心15 min，取血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行指標(biāo)檢測。

流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓和外周血c-kit+干細(xì)胞數(shù)量：大鼠麻醉后，腹主動脈采血置于含乙二胺四乙酸（EDTA）的抗凝管，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，加入c-kit+-APC熒光抗體孵育，磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH=7.4）清洗并重懸后上流式細(xì)胞儀檢測外周血c-kit+干細(xì)胞數(shù)。分離大鼠股骨，在骨骺端剪開一小缺口插入10 ml注射器，用PBS沖出骨髓，加入紅細(xì)胞裂解液，加入c-kit+-PE熒光抗體孵育，PBS清洗并重懸后上流式細(xì)胞儀檢測骨髓c-kit+干細(xì)胞數(shù)。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。各組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，若方差齊則采用單因素方差分析，方差不齊時采用Welchi檢驗，必要時采用LSD檢驗進(jìn)行兩兩比較；若不符合正態(tài)分布，計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)的比較（圖1）

圖1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)的比較（n=6）

心肌梗死組、心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死

2.2 各組大鼠的動物行為學(xué)指標(biāo)比較（圖2）

曠野試驗結(jié)果顯示，相比于心肌梗死組，心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組的大鼠水平運動得分和垂直運動得分減少，活動能力下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。高架十字迷宮試驗結(jié)果顯示，相比于心肌梗死組，心肌梗死合并焦慮組大鼠傾向于待在閉合臂里，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。強迫游泳試驗顯示，相比于心肌梗死組，心肌梗死合并抑郁組大鼠水中不動時間延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠病理染色結(jié)果的比較（圖3）

大腦HE染色結(jié)果示：假手術(shù)組大鼠的大腦海馬CA3區(qū)細(xì)胞排列整齊，連接緊密，細(xì)胞質(zhì)淡粉著色；心肌梗死組大鼠的大腦海馬CA3區(qū)細(xì)胞排列稍顯紊亂，心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組大鼠的大腦海馬CA3區(qū)細(xì)胞排列紊亂明顯，部分細(xì)胞質(zhì)染色不均。心肌HE染色結(jié)果示：假手術(shù)組大鼠的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肌纖維排列整齊規(guī)則，肌絲清晰；心肌梗死組、心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組大鼠的心肌肌纖維斷裂，核碎裂，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，間質(zhì)纖維化增多。心肌Masson染色結(jié)果示：假手術(shù)組心肌纖維紅染，肌細(xì)胞排列整齊，橫紋可見，未見明顯膠原纖維；心肌梗死組、心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌橫紋消失，腫脹并伴有數(shù)量減少，組織間質(zhì)可見顯著膠原纖維及炎性浸潤，梗死部位可以見空泡樣改變，膠原纖維呈彌散樣分布。

圖2 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較（n=6）

圖3 各組大鼠心肌、大腦組織HE染色（×400）和Masson染色（×400）結(jié)果

2.4 各組大鼠外周血NF-κB含量的比較（圖4）

ELISA結(jié)果顯示， 心肌梗死合并焦慮組、心肌梗死合并抑郁組大鼠的NF-κB含量高于心肌梗死組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠外周血NF-κB含量（n=6）

2.5 各組大鼠的骨髓和外周血c-kit+干細(xì)胞數(shù)量比較（圖5）

相比于心肌梗死組，心肌梗死合并焦慮組大鼠骨髓合并抑郁組的LVEF和LVFS低于假手術(shù)組，LVEDV和LVESV高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。心肌梗死合并焦慮組和心肌梗死合并抑郁組的LVEF和LVFS低于心肌梗死組，LVEDV和LVESV高于心肌梗死組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。c-kit+干細(xì)胞數(shù)減少，心肌梗死合并抑郁組大鼠外周血c-kit+干細(xì)胞數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)比較各組大鼠骨髓和外周血c-kit+細(xì)胞數(shù)量（n=6）

3 討論

本研究采用經(jīng)典的結(jié)扎冠狀動脈左前降支方法建立心肌梗死模型，采用不確定空瓶刺激法建立焦慮模型，采用孤養(yǎng)+慢性不可預(yù)知性刺激建立抑郁模型。目前對焦慮或抑郁的評價多采用經(jīng)典的行為學(xué)評價。焦慮動物表現(xiàn)為對高架十字迷宮中開放臂的探究次數(shù)減少以及停留時間減少，曠場實驗中水平或者垂直運動能力下降。抑郁動物表現(xiàn)為在曠場實驗中水平或者垂直運動能力下降低以及在強迫游泳實驗中漂浮時間增加[7]。本研究結(jié)果證明，心肌梗死、心肌梗死合并焦慮以及心肌梗死合并抑郁等動物模型成功建立，可用于心肌梗死合并焦慮或抑郁的疾病研究。

c-kit+干細(xì)胞能夠修復(fù)損傷的心肌，但是由于心臟源性干細(xì)胞數(shù)量較少難以達(dá)到理想修復(fù)效果。心肌梗死發(fā)生后，壞死的心肌組織刺激機(jī)體釋放的NF-κB等炎癥因子可動員自身干細(xì)胞遷移至心肌梗死部位，該過程在心肌梗死發(fā)生3～7天后達(dá)到高峰，其中約有74%的c-kit+干細(xì)胞來源于骨髓[9-12]。而過度增加的NF-κB可介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮間的黏附反應(yīng)促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的凋亡[3]。因此，NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是骨髓干細(xì)胞動員的雙刃劍，在一定范圍內(nèi)，炎癥反應(yīng)可促進(jìn)骨髓c-kit+干細(xì)胞動員，而當(dāng)炎癥反應(yīng)增強到某個程度，則會減弱甚至抑制骨髓c-kit+干細(xì)胞的動員。

本研究結(jié)果顯示，相比于心肌梗死組大鼠，心肌梗死合并焦慮組和心肌梗死合并抑郁組的大鼠血清NF-κB的含量升高，且心功能明顯減退，證明了焦慮抑郁導(dǎo)致心肌梗死后心功能的惡化，并加重心肌梗死發(fā)生后的炎癥反應(yīng)。此外，相比于心肌梗死組大鼠，心肌梗死合并焦慮組及心肌梗死合并抑郁組的大鼠骨髓或外周血c-kit+細(xì)胞數(shù)量均存在不同程度下降，證明焦慮或抑郁可增加心肌梗死后NF-κB的含量，抑制c-kit+干細(xì)胞的動員。

綜上所述，采用不確定空瓶法聯(lián)合冠狀動脈左前降支結(jié)扎法可建立急性心肌梗死合并焦慮的大鼠模型，采用孤養(yǎng)+慢性不可預(yù)知性刺激聯(lián)合冠狀動脈前降支結(jié)扎法可建立急性心肌梗死合并抑郁大鼠模型。焦慮、抑郁可抑制心肌梗死發(fā)生后骨髓c-kit+干細(xì)胞的動員，且這一過程可能與炎癥反應(yīng)增強有關(guān)。本研究揭示了焦慮、抑郁影響冠心病預(yù)后的部分機(jī)制，但仍需從細(xì)胞實驗角度對本研究結(jié)論進(jìn)行驗證。