聚乙烯醇-羧甲基纖維素鈉復(fù)合膜預(yù)防血管開放術(shù)后黏連的實(shí)驗(yàn)研究

何楠，龍安妮，胡暢，劉思博，王遷，邱菊，陳東，李雷

近20年來，心血管外科技術(shù)飛速發(fā)展，一些較高難度的手術(shù)例數(shù)與日俱增，同時(shí)再次手術(shù)的比率亦有增多的趨勢[1]。然而，首次手術(shù)區(qū)域組織黏連增加了再次手術(shù)解剖的難度、手術(shù)干預(yù)時(shí)間及組織損傷的風(fēng)險(xiǎn)。研究顯示，血管周圍黏連程度，也影響手術(shù)血管的通暢性[2-5]。物理屏障是臨床上預(yù)防術(shù)后黏連最有效的方法，但目前尚無針對(duì)人體血管的防黏連產(chǎn)品，且市售材料不能滿足血管開放手術(shù)所需的高標(biāo)準(zhǔn)及要求。研制一種針對(duì)血管手術(shù)的防黏連膜，并兼具生物相容性好、柔韌性佳、黏附性強(qiáng)、存留時(shí)間足夠、可吸收、抗感染能力強(qiáng)的優(yōu)勢，勢在必行[1]。聚乙烯醇（PVA）及羧甲基纖維素鈉（CMC）這兩種聚合物材料已經(jīng)美國食品與藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于人體，均具有良好的水溶性和組織相容性。PVA既可制成黏度較大的水凝膠，也可做成軟膏于創(chuàng)傷處成膜而發(fā)揮其他藥物作用，CMC則具備防黏連和一定的止血效果，其干預(yù)黏連的機(jī)制主要是降低成纖維細(xì)胞的活性以及機(jī)械隔離作用[6,7]。通過對(duì)兩種材料的復(fù)合與改性，有望生成一種新型的較理想的血管外科術(shù)后防黏連產(chǎn)品。本文采用新西蘭大白兔動(dòng)物模型，通過皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等對(duì)PVA-CMC復(fù)合膜預(yù)防血管術(shù)后黏連的安全性及有效性進(jìn)行研究評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

材料 ：PVA-CMC復(fù)合膜（三層）規(guī)格為5 cm×5 cm，制備方法見后。新西蘭大白兔：體重2.5 kg，不分雄雌。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

防黏連膜的制備及理化性質(zhì)檢測：（1）復(fù)合膜制備：中間凝膠膜層中PVA-1799：CMC以30 : 2的比例同時(shí)溶解于120份離子水中得到混合溶液，并以5 mg/ml的劑量加入塑形劑，將此混合溶液流延至玻璃培養(yǎng)皿中至厚度500 μm，然后冷凍-解凍過程循環(huán)三次后即制備完成。上下薄膜層中PVA-1788:CMC以2:1的比例同時(shí)溶解于離子水中得到混合溶液，以上述方法經(jīng)過3次冷凍-解凍過程即可。將制作完成的復(fù)合膜成分放入環(huán)氧乙烷保鮮袋中行環(huán)氧乙烷滅菌，并在常溫下保存?zhèn)溆?。?）厚度測定：將干態(tài)膜干燥至恒質(zhì)量，千分尺測定膜的9個(gè)不同位置的厚度，取平均值為干態(tài)膜的厚度。將膜浸泡在蒸餾水中24 h，吸干其表面水分，如上同法測定并取平均值為濕態(tài)膜的厚度。（3）含水率測定：將膜浸泡在常溫的蒸餾水中24 h，用濾紙吸干其表面的水分，從膜上均勻裁剪數(shù)個(gè)1.0 cm×1.0 cm的樣品，并稱質(zhì)量取得平均值（w1）。將這些樣品放于70℃的烘箱中烘干至恒質(zhì)量，取平均值（w）。膜的含水率（%）=（w1-w）/w×100%。（4）溶脹比測定：將干態(tài)膜裁剪成直徑為2.5 cm的圓片，浸泡在蒸餾水中溶脹24 h。用千分尺測量圓片的直徑（φ）和干態(tài)及濕態(tài)膜（σ）的厚度。溶脹比。（5）力學(xué)性能測定：將膜裁剪成寬20 mm、夾持長度40 mm，通過電子拉力測試機(jī)以20 mm/min的拉伸速率測量其拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率。（6）結(jié)構(gòu)相容性表征：用超高分辨場發(fā)射掃描電鏡JSM7401觀測復(fù)合膜的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)并分析共混相容性。樣品尺寸2.5 cm×2.5 cm，加速電壓為3.0 kV。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16175-2008[8]進(jìn)行測試，對(duì)PVA-CMC膜進(jìn)行毒性分級(jí)。同時(shí)用顯微鏡觀察法對(duì)細(xì)胞毒性反應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)分。

皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)：采用3只體重約2.5 kg的新西蘭大白兔，按順序進(jìn)行生理鹽水（背部最左）、生理鹽水浸提液（背部最右）、芝麻油（脊正中線右側(cè)）、芝麻油浸提液（脊正中線右側(cè)）皮內(nèi)注射，注射劑量為0.2 ml/每注射點(diǎn)，注射點(diǎn)之間間隔2 cm，共10個(gè)注射點(diǎn)。注射完成后在1 h、24 h、48 h和72 h時(shí)分別進(jìn)行拍照，并觀察注射的部位有無紅斑或水腫等情況，按照皮內(nèi)刺激反應(yīng)記分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算原發(fā)性刺激指數(shù)（PII）。

動(dòng)物頸動(dòng)脈模型建立：新西蘭白兔16只（體重2.5 kg，雌雄不限），將兔進(jìn)行自身對(duì)照， 即一側(cè)頸動(dòng)脈PVA-CMC復(fù)合膜植入（實(shí)驗(yàn)組）和對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈實(shí)施假手術(shù)（對(duì)照組）。于氣管旁胸鎖乳突肌深面，分離兔頸總動(dòng)脈，小心游離頸總動(dòng)脈周圍組織，并摩擦使之明顯滲血，注意保護(hù)伴行神經(jīng)。將PVACMC三層膜裁剪成適合大小約15 mm×8 mm，置入并包裹一側(cè)頸總動(dòng)脈，用6-0 PROLENE縫線標(biāo)記及固定其位置，于對(duì)側(cè)頸部單純游離頸總動(dòng)脈，摩擦使之明顯滲血后用6-0 PROLENE縫線標(biāo)記其手術(shù)位置。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集與觀察：（1）大體觀察：術(shù)后4周、12周分別處死實(shí)驗(yàn)兔各8只，肉眼觀測術(shù)區(qū)頸動(dòng)脈與周圍組織黏連的程度，并行黏連程度分級(jí)：0級(jí)（無黏連）、Ⅰ級(jí)（黏連輕薄，分離不易出血）、Ⅱ級(jí)（中度黏連，需要一些銳性分離，這個(gè)過程導(dǎo)致中度出血）、Ⅲ級(jí)（黏連致密、彌漫，需要大量的銳性分離，容易出血）。（2）組織學(xué)觀察：將兔雙側(cè)頸動(dòng)脈與周圍黏連最明顯部位的組織一起取出，于10%甲醛固定48 h后石蠟包埋并切片，蘇木精-伊紅（HE）染色并封片。顯微鏡下觀察血管與材料及周圍組織的病理情況，微觀黏連評(píng)分系統(tǒng)將組織炎癥進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)（無炎癥反應(yīng)，未見炎性細(xì)胞）、Ⅰ級(jí)（輕度炎癥反應(yīng)，可見少量淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞、偶可見巨細(xì)胞）、Ⅱ級(jí)（中度炎癥反應(yīng)，可見嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨細(xì)胞）、Ⅲ級(jí)（許多炎性細(xì)胞，可見微小膿腫）；同時(shí)再對(duì)組織周邊纖維化反應(yīng)進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)（無纖維化反應(yīng)）、Ⅰ級(jí)（輕度、疏松、局限性纖維化）、Ⅱ級(jí)（中度纖維化，薄層局灶纖維結(jié)締組織，纖維素沉積）、Ⅲ級(jí)（致密、厚層、彌漫性纖維化）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組獨(dú)立樣本比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

16只實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后精神、飲食、活動(dòng)正常，均存活，切口愈合好，無紅腫、滲出或竇道形成。取材前可見頸動(dòng)脈周圍組織無損傷。

2.2 復(fù)合膜的理化檢測及生物相容性測試

理化檢測：（1）厚度測定：干態(tài)膜厚度為（0.320±0.185） mm；濕態(tài)膜厚度為（0.819±0.210） mm。（2）含水率測定： 94.85%。（3）溶脹比測定：（3.22±0.21）%。（4）力學(xué)性能測定：干態(tài)膜拉伸 強(qiáng)度 為（27.19±2.43）MPa，斷 裂伸 長率 為（84.5±4.7）%。濕態(tài)膜拉伸強(qiáng)度為（19.63±1.01）MPa，斷裂伸長率為（97.2±8.0）%。（5）結(jié)構(gòu)相容性表征：掃描電鏡在放大倍數(shù)104下可見復(fù)合膜表面略粗糙，但完整、未見層次分離。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT法）：PVA-CMC膜1級(jí)細(xì)胞毒性。

皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)：計(jì)算得出復(fù)合膜+生理鹽水浸提液的原發(fā)刺激指數(shù)（PII）為0；復(fù)合膜+芝麻油浸提液PII最高值為0.27，平均PII值為0.17低于國家標(biāo)準(zhǔn)1.0的規(guī)定要求，可判定PVA-CMC復(fù)合膜無皮內(nèi)刺激作用。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

頸動(dòng)脈模型大體觀察：術(shù)后4周、12周分別處死實(shí)驗(yàn)兔并取材，肉眼觀察可見實(shí)驗(yàn)組（圖1A）手術(shù)區(qū)域辨識(shí)度極高，膜與周圍組織（氣管、頸前肌群等）的黏連程度低，極少見纖細(xì)絲狀黏連，膜的活動(dòng)度高，可輕松與周圍組織分離，暴露其包裹的頸動(dòng)脈，過程未見出血。實(shí)驗(yàn)組4周取材的黏連程度評(píng)級(jí)分布如下：0級(jí)7例、Ⅰ級(jí)1例、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)均0例；12周取材情況如下：0級(jí)8例，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)均0例。肉眼觀察對(duì)照組（圖1B）血管與周圍組織黏連致密、彌漫，難以分辨術(shù)區(qū)組織結(jié)構(gòu)，需要大量的銳性分離，極易出血。對(duì)照組4周取材結(jié)果：0級(jí)、Ⅰ級(jí)均為0例，Ⅱ級(jí)2例，Ⅲ級(jí)6例；12周取材結(jié)果：0級(jí)、Ⅰ級(jí)均為0例，Ⅱ級(jí)1例，Ⅲ級(jí)7例。不論術(shù)后4周還是12周，對(duì)照組血管與周圍組織的黏連程度均明顯高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0002）。同組內(nèi)術(shù)后12周與術(shù)后4周的取材結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

頸動(dòng)脈模型組織學(xué)觀察：對(duì)術(shù)區(qū)取材并行HE染色、封片，顯微鏡下觀察組織周圍的炎癥反應(yīng)及纖維囊化形成情況。術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組復(fù)合膜周圍少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及多核巨細(xì)胞，少許纖維母細(xì)胞增生；對(duì)照組血管擴(kuò)張充血，血管內(nèi)皮無炎癥浸潤，周圍脂肪組織中可見灶狀細(xì)胞團(tuán)，血管周圍有一條細(xì)長、薄層局灶纖維結(jié)締組織。術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組復(fù)合膜膜片與相鄰組織呈分離狀態(tài)，由少量纖維條索包裹，未見炎性細(xì)胞，少許纖維組織增生（圖1C）；對(duì)照組血管擴(kuò)張充血，血管內(nèi)皮無炎癥，血管周圍可見一條致密、厚層、彌漫性纖維化組織（圖1D）。就組織周圍炎癥反應(yīng)程度而言，無論實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組的術(shù)后4周及12周取材結(jié)果均是0級(jí)8例、其他0例，兩組樣本差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。而頸動(dòng)脈周圍組織纖維化反應(yīng)程度上，實(shí)驗(yàn)組4周取材結(jié)果為0級(jí)0例，Ⅰ級(jí)2例，Ⅱ級(jí)6例，Ⅲ級(jí)0例； 12周取材結(jié)果為0級(jí)0例，Ⅰ級(jí)4例，Ⅱ級(jí)4例，Ⅲ級(jí)0例；對(duì)照組4周取材結(jié)果為0級(jí)0例、Ⅰ級(jí)0例，Ⅱ級(jí)3例，Ⅲ級(jí)5例； 12周取材結(jié)果為0級(jí)0例，Ⅰ級(jí)0例，Ⅱ級(jí)2例，Ⅲ級(jí)6例。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，術(shù)后4周及12周對(duì)照組纖維化程度均明顯強(qiáng)于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015，P=0.002）。

圖1 頸動(dòng)脈模型大體觀察和組織學(xué)觀察結(jié)果

3 討論

血管開放手術(shù)后經(jīng)常面臨著二次甚至多次手術(shù)的需求。術(shù)后血管周圍組織黏連為二次手術(shù)的安全性帶來巨大挑戰(zhàn)。另有研究表明，血管重塑與血管術(shù)后再狹窄相關(guān)，其機(jī)制包括外周組織源性平滑肌細(xì)胞通過炎癥、黏連遷移至術(shù)區(qū)靶血管周邊進(jìn)而造成內(nèi)膜增生[9,10]。由于血管結(jié)構(gòu)及其自身搏動(dòng)和受外力較多等特殊性，對(duì)防黏連材料的柔軟性、粘附性及強(qiáng)韌性方面有更高的要求。到目前為止，仍沒有一種理想的、價(jià)格適中且適用于血管的防黏連產(chǎn)品。國外雖然已有PVA-CMC復(fù)合凝膠材料完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)的安全性報(bào)告[11]，但因?yàn)檠懿珓?dòng)及長期受外力的特性，其膠態(tài)無法為血管提供全周向防黏連效果。為降低其流動(dòng)性而更好地適應(yīng)于血管手術(shù)特殊要求，本研究所用的PVA-CMC防黏連材料設(shè)計(jì)成了粘附性強(qiáng)的復(fù)合膜狀，分為中間凝膠膜層及上下薄膜層。理論上可以大大降低血管搏動(dòng)及外部力量對(duì)手術(shù)血管的摩擦及軸向剪切力，保持全周向抗黏連能力的同時(shí)保護(hù)血管外膜結(jié)構(gòu)。本研究表明，該復(fù)合膜柔軟、強(qiáng)韌、黏附性好，有望成為開放性血管手術(shù)較為理想的防黏連材料。

已有研究提示隨著時(shí)間進(jìn)展，機(jī)體對(duì)于PVACMC復(fù)合膜免疫應(yīng)答逐漸減弱[12]，其組織相容性良好。本研究將復(fù)合膜植入實(shí)驗(yàn)兔頸動(dòng)脈周邊，以術(shù)后4周、12周為節(jié)點(diǎn)進(jìn)行取材，是因?yàn)榇藭r(shí)間已經(jīng)超過了術(shù)后黏連發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期(1周)及黏連的完全成熟期（4～8周），便于觀察復(fù)合膜對(duì)防止術(shù)后血管周圍黏連的最終效果。實(shí)驗(yàn)通過肉眼觀察和組織學(xué)觀察均可顯示復(fù)合膜包裹的血管周圍組織黏連極少、纖維化程度小，且正因復(fù)合膜周圍形成了非常薄的纖維囊腔，使之極易與周邊組織分離，大大減少了二次手術(shù)解剖時(shí)可能出現(xiàn)的副損傷。術(shù)后12周，血管周圍組織內(nèi)的炎癥及免疫應(yīng)答基本消失殆盡，故此時(shí)觀察兩組術(shù)區(qū)均未見炎性細(xì)胞浸潤，可解釋實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)區(qū)組織炎癥反應(yīng)程度一致這一結(jié)果。復(fù)合膜具有良好的抗纖維化、防黏連作用，作為植入體內(nèi)的異物卻未在術(shù)后較早期（4周）導(dǎo)致術(shù)區(qū)炎癥反應(yīng)，提示復(fù)合膜除了物理隔絕作用外，還可能存在一定的抗炎作用，推測其機(jī)制可能與該復(fù)合膜上下兩層水溶性膜有關(guān)，該膜植入體內(nèi)后最先發(fā)生水溶性膜的緩慢溶解，其中CMC成分被緩慢釋放出來，CMC具有一定的防止感染和止血效果，其與血液接觸時(shí)可將血液中水分溶脹產(chǎn)生黏膠狀物，增強(qiáng)血液的濃度與粘性而降低了流速，形成粘性體后將毛細(xì)血管殘端封閉，達(dá)到止血效果的同時(shí)減少了血液內(nèi)炎癥介質(zhì)和炎性細(xì)胞的滲出，以及它們在創(chuàng)面區(qū)域的聚集。

本研究結(jié)果證實(shí)PVA-CMC復(fù)合膜符合國頒標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886對(duì)生物材料、醫(yī)療器械的生物學(xué)評(píng)價(jià)（等同國際標(biāo)準(zhǔn)IS010993）。初步在體實(shí)驗(yàn)證明具備較佳的血管手術(shù)后防黏連效果。用于制備該國產(chǎn)新型生物防黏連膜的原材料容易獲得，適合大規(guī)模生產(chǎn)，其多種優(yōu)勢有望應(yīng)用于血管手術(shù)中。除此之外，對(duì)于心臟及主動(dòng)脈的二次手術(shù)，黏連重者需要更多的銳性分離，破裂出血、手術(shù)時(shí)間及麻醉風(fēng)險(xiǎn)增高[13]，本研究所用的復(fù)合膜是否在其他外科手術(shù)中也能提供良好的防黏連效果，值得考證和期待。