氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜法研究普洱茶醇溶物揮發(fā)性成分

吳 娜，劉 衛(wèi)，田先嬌，楊新周

(1. 紅河學(xué)院 理學(xué)院，云南 蒙自 661199；2. 云南省高?！暗胤教厣Y源利用與新材料”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自 661199；3. 德宏師范高等?？茖W(xué)校理工學(xué)院，云南 德宏 678400)

普洱茶采用曬青毛茶為原料，經(jīng)過特定發(fā)酵加工工藝制成，形褐紅，湯紅濃、透亮，香氣獨(dú)特陳香，味醇厚甘甜[1]，具有降血脂、助消化、解毒、防癌與抗癌、健齒護(hù)齒、抗衰老和美容等多種保健功效，深受消費(fèi)者的喜愛[2-3]. “陳香”是普洱茶的主要特點(diǎn)，不同品牌、不同產(chǎn)地的普洱茶，其色、香、味具有不同特征. 相同產(chǎn)地、相同品牌的普洱茶因放置年限的不同，也會呈現(xiàn)出色、香、味的不同變化[4-8]. 普洱茶的這種變化被人們稱之為“越陳越香”，此特點(diǎn)已成為引導(dǎo)普洱茶消費(fèi)的主要指標(biāo)，是普洱茶被品味及感受的主要特征.

普洱茶的香氣成分是茶原料在制茶過程中進(jìn)行復(fù)雜生化反應(yīng)后的產(chǎn)物. 目前，已從茶葉中分離提取出700多種香氣成分，包括醇、醛、酮、酯、酸、氮和氧雜環(huán)化合物等[3]. 20世紀(jì)70年代開始應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)控制藥物質(zhì)量. 指紋圖譜的研究已涉及多種方法，包括色譜法、光譜法、氣質(zhì)聯(lián)用以及液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù). 其中色譜法為主流方法，已成為公認(rèn)的常規(guī)分析手段. 目前，指紋圖譜技術(shù)已在環(huán)保、石油加工、食品藥品質(zhì)量控制、電子技術(shù)和生物化工等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[9-10]. 茶葉指紋圖譜研究是一種綜合、可量化的鑒定手段，它是建立在化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價(jià)茶葉質(zhì)量的真實(shí)性[11]，包括獲得圖譜信息和圖譜信息處理. 通過對圖譜信息解讀、比較、判斷，可以從大量指紋圖譜數(shù)據(jù)中得到有關(guān)規(guī)律.

目前，以外觀、口感、視覺等為主的描述性質(zhì)量評價(jià)無法滿足同產(chǎn)地的普洱茶其色、香、味的不同特征. 相同產(chǎn)地、相同品牌的普洱茶放置需求也受主觀人為因素影響較大，缺乏統(tǒng)一的定性定量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn). 再者，因品牌、年限的差異，普洱茶也會呈現(xiàn)出色、香、味的不同變化. 因此，以中國馳名商標(biāo)大益普洱茶中銷量最大的生茶7542為研究對象，建立普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)指紋圖譜的方法. 對指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算和主成分分析，為普洱茶7542提供鑒別信息豐富的檢測方法，利于促進(jìn)普洱茶產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)升級，促進(jìn)普洱茶的持續(xù)健康發(fā)展.

1 試驗(yàn)部分

1. 1 儀器與試劑

GC-MS-QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，毛細(xì)管柱：Rtx-5Ms(30.0 m×0.25 μm×0.25 mm)、Rtx-35(30.0 m×0.25 μm×0.25 mm)、Rtx-1(30.0 m×0.25 μm×0.25 mm)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA OSB-2100)，超聲波清洗器(HS-3120，環(huán)保儀器廠)，數(shù)顯電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，天津華鑫儀器廠)，無水乙醇(AR，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司).

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 供試樣品

不同年限、不同批次的10個(gè)普洱茶生茶7542樣品均來自于勐海茶廠，年限及批次如表1所列，其中106為參考樣，其它均為比對樣. 將樣品于研缽中研細(xì)，過0.3 mm篩，密封儲存于廣口瓶中.

1. 2. 2 檢測條件

GC條件：柱箱溫度150 ℃；進(jìn)樣口溫度230 ℃；分流比15∶1；柱流量0.57 mL/min；總流量12.1 mL/min；吹掃流量3.0 mL/min；載氣氦氣，純度99.999%；毛細(xì)管柱Rtx-5MS；程序升溫150 ℃保持1 min，再以2 ℃/min 升至230 ℃，并保持10 min，總運(yùn)行時(shí)間55 min.

表1 普洱茶樣品信息Table 1 Sample informations of Pu-erh tea

MS條件：離子源溫度200 ℃；接口溫度230 ℃；檢測器電壓0.88 kV；溶劑延遲時(shí)間5 min；質(zhì)量數(shù)掃描范圍：40～800.

靜態(tài)頂空(HS)進(jìn)樣條件：進(jìn)樣針體積2.5 mL；進(jìn)樣體積1.0 mL；振蕩箱溫度110 ℃；振蕩時(shí)間20 min；振蕩速度250 r/min；氣體吹針時(shí)間3 min；進(jìn)樣速度500 μL/s；氣相運(yùn)行時(shí)間55 min；壓力1 Pa.

1. 2. 3 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇50 mL，使用超聲提取30 min，過濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至10 mL，過濾至頂空進(jìn)樣瓶，得樣品溶液.

1. 2. 4 數(shù)據(jù)處理

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004(A)版》和SPSS 19.0軟件處理.

2 結(jié)果與討論

2. 1 提取液體積的選擇

稱取1.000 g 106樣品三份，分別加入20、30、50 mL 95%的乙醇溶液，超聲提取30 min，過濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至10 mL，過濾至頂空進(jìn)樣瓶，上機(jī)測定，考察不同乙醇體積對醇提物成分的影響. 試驗(yàn)結(jié)果表明：采用50 mL乙醇提取的成分相對較多，各成分的峰面積相對均勻. 采用30 mL乙醇提取的成分峰面積相對較大，但是成分相對少且基線不平穩(wěn). 因此，最佳提取液體積為50 mL.

2. 2 超聲提取時(shí)間的選擇

稱取三份106樣品1.000 g樣品，加入50 mL 95%的乙醇溶液，分別超聲提取10、20、30、40、60 min，過濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至10 mL，過濾至頂空進(jìn)樣瓶，上機(jī)測定. 探討提取時(shí)間對醇溶物成分的影響. 試驗(yàn)結(jié)果表明：提取時(shí)間選擇30、40、60 min時(shí)，色譜峰比提取10、20 min時(shí)較多，但這三者之間的色譜峰數(shù)目變化不大. 提取時(shí)間選擇20 min時(shí)，成分相對較少，而且僅有三種主要成分. 提取時(shí)間選擇10 min時(shí)，提取的成分多，但是各成分的峰面積值相對較小. 因此，普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分的超聲提取時(shí)間為30 min.

2. 3 HS振蕩箱溫度的選擇

稱取7份1.000 g 106樣品，加入50 mL 95%的乙醇溶液，超聲提取30 min，過濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至10 mL，過濾至頂空進(jìn)樣瓶. 設(shè)置HS的振蕩箱溫度為60、70、80、90、100、110、120 ℃，探討溫度對普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分的影響. 試驗(yàn)結(jié)果表明：普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分的HS振蕩箱溫度選擇110 ℃時(shí)，其色譜峰較多，且峰高較大.

2. 4 振蕩時(shí)間的選擇

稱取4份1.000 g 106樣品，加入50 mL 95%的乙醇溶液，超聲提取30 min，過濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至10 mL，過濾至頂空進(jìn)樣瓶. 設(shè)置HS振蕩時(shí)間為10、15、20、30 min，探討振蕩時(shí)間對普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分的影響. 試驗(yàn)結(jié)果表明：普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分的HS振蕩時(shí)間選擇20 min時(shí)，色譜峰數(shù)目較多，且峰高較大.

2. 5 不同年限、不同批次普洱茶7542系列樣品醇溶物揮發(fā)性成分指紋圖譜的建立

將不同年限、不同批次的普洱茶7542系列504、505、606、608、703、801、810、901、912樣品各稱取1.000 g，加入50 mL 95%乙醇超聲提取30 min，頂空進(jìn)樣條件：振蕩箱溫度110 ℃，振蕩時(shí)間20 min，濃縮至10 mL，過濾至頂空進(jìn)樣瓶，測定. 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004(A)版》軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立了不同年限、不同批次的普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分的GC-MS指紋圖譜，結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同年限、不同批次的普洱茶7542系列樣品醇溶物揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜從下往上依次為504、505、606、608、703、801、810、901、912、R(106)Fig. 1 GC-MS fingerprints of volatile components of alcohol-solute in Pu-erh tea 7542 series sample of different ages and batchesFrom bottom to top: 504、505、606、608、703、801、810、901、912、R(106)

2. 6 普洱茶7542系列樣品醇溶物揮發(fā)性成分指紋圖譜分析

2. 6. 1 相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004(A)版》軟件對普洱茶7542系列樣品醇溶物揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，選用普洱茶7542(106)作為參照圖譜，計(jì)算所有樣品的相似度，結(jié)果如表2所列.

表2 普洱茶7542系列樣品醇溶物揮發(fā)性成分指紋圖譜相似度Table 2 Similarity of fingerprints of volatile components of alcohol-solute compounds in Pu-erh tea 7542 series samples

由表2可知，相似度不低于0.900的樣品是606、608、901、912，相似度不低于0.800并且不高于0.900的樣品是505、810，相似度不低于0.700并且不高于0.800的樣品是504、703、801，而樣品606、608、901、912和106的譜峰相似度較高，樣品505、810和106的譜峰相似度有略微的差異，樣品504、703、801和106的譜峰相似度差異較大，說明不同年限、不同批次的9個(gè)普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分和參照樣本相比發(fā)生了改變，但變化的幅度不大.

2. 6. 2 主成分分析

對普洱茶7542系列樣品醇溶物揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜進(jìn)行積分，選擇峰面積百分含量大于0.1%的峰為揮發(fā)性成分，普洱茶7542系列樣品醇溶物中共有揮發(fā)性成分12個(gè)，其信息如表3所列. 將表3數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 19.0軟件中進(jìn)行選降維-因子分析和最大方差法分析，其結(jié)果如表4所列.

表3 普洱茶7542系列樣品醇溶物揮發(fā)性成分共有峰面積百分含量Table 3 Percentages of common peak area of volatile components of alcohol-solute compounds in Pu-erh tea 7542 series samples

表4 普洱茶7542系列樣品醇溶物揮發(fā)性成分主成分全部方差解釋Table 4 Principal component variance values of volatile components of alcohol-solute substances in Pu-erh tea 7542 series samples

由表3可看出，2-羥甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛、N-丁基苯磺酰胺、咖啡因、3-羥基月桂酸、不飽和脂肪酸、鄰苯二甲酸單乙基己基酯和抗壞血酸櫚酸酯的峰面積百分含量相對較大，9個(gè)不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物中12個(gè)揮發(fā)性成分峰面積百分含量有差異，其中2007年第3批和2008年第1批12個(gè)揮發(fā)性成分峰面積總量較大，是2008年第10批峰面積總量的2倍多，說明同年不同批次的普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分含量有差異，可用普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分鑒別和評價(jià)不同年限不同批次的普洱茶7542.

由表4可知，9個(gè)不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分中共提取了2個(gè)成分，即2-羥甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛和N-丁基苯磺酰胺，其特征值大于1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)90.2%. 因?yàn)?個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于80%，所以能較好的代表9個(gè)不同年限、不同批次普洱茶7542的全部信息，可以用主成分分析來反映樣品的全部信息，可測定9個(gè)不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物中2-羥甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛和N-丁基苯磺酰胺的含量差異評價(jià)普洱茶7542的質(zhì)量.

3 結(jié)論

論文以普洱茶7542為參考樣本，乙醇為溶劑，超聲提取制備普洱茶醇溶物，建立了普洱茶7542醇溶物氣相色譜質(zhì)譜(GC/MS)指紋圖譜，同時(shí)對其指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算和主成分分析. 試驗(yàn)結(jié)果表明，普洱茶7542醇溶物的最佳提取方法是采用50 mL 95%乙醇超聲提取30 min，頂空進(jìn)樣條件為振蕩箱溫度110 ℃，振蕩時(shí)間20 min. 對9個(gè)不同年限、不同批次的普洱茶7542系列樣品醇溶物揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜的相似度分析和主成分分析可知，測定樣品醇溶物揮發(fā)性成分圖譜與對照圖譜之間的相似度在0.706～0.906之間，說明不同年限、不同批次的9個(gè)普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分和參照樣本相比發(fā)生了改變，但變化的幅度不大，但共有成分峰面積百分含量存在差異. 特別是2007年第3批和2008年第1批，12個(gè)揮發(fā)性成分峰面積總量較大，分別是77.55%和80.39%，是2008年第10批峰面積總量的2倍多，說明同年不同批次的普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分含量有差異. 對測定樣品醇溶物揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，9個(gè)不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物揮發(fā)性成分中共提取了2個(gè)成分，即2-羥甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛和N-丁基苯磺酰胺，其特征值大于1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)90.2%，因?yàn)?個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于80%，所以能較好的代表9個(gè)不同年限、不同批次普洱茶7542的全部信息，可以用主成分分析來反映樣品的全部信息，可測定9個(gè)不同年限、不同批次普洱茶7542醇溶物中2-羥甲基-2-甲基-吡咯烷-1-甲醛和N-丁基苯磺酰胺的含量差異評價(jià)普洱茶7542的質(zhì)量.