無魚粉無魚油飼料喂養(yǎng)下大黃魚幼魚個體間生長及相關(guān)基因表達(dá)差異

劉靈婕，林曉煜，王秋榮，葉 坤，王志勇

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021)

0 引言

魚粉因其蛋白質(zhì)含量高，氨基酸配比較為均衡，且具適口性好、易于消化吸收等優(yōu)點，一直以來是魚類飼料中的優(yōu)質(zhì)蛋白原料；魚油則因富含其他油脂所缺乏的高度不飽和脂肪酸(HUFA)，是海水養(yǎng)殖魚類攝入必需脂肪酸的重要來源。二者在水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展中扮演著重要角色。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，傳統(tǒng)海水魚類飼料中高比例魚油和魚粉的添加量使得飼料成本大幅提升，直接導(dǎo)致了養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的縮減。為了應(yīng)對魚粉、魚油短缺局面以及節(jié)約飼料成本，擺脫水產(chǎn)飼料對魚油、魚粉的過度依賴，國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)者進(jìn)行了大量有關(guān)魚類飼料中魚油魚粉替代的研究[1-6]。

大黃魚(Larimichthyscrocea)是我國當(dāng)前育苗量和養(yǎng)殖量最大的海水經(jīng)濟(jì)魚類，有我國“海水國魚”之稱，研究者也在大黃魚養(yǎng)殖實驗中做了諸多嘗試。相關(guān)結(jié)果表明，利用豆粕、小麥蛋白粉等植物蛋白源，或肉骨粉、血粉等動物蛋白源均可以替代大黃魚飼料中的部分魚粉，但替代超過一定水平則會對大黃魚的生長與健康狀態(tài)造成較嚴(yán)重的不良影響[7-11]。在魚粉含量不低于45%(基礎(chǔ)飼料中魚粉所占比)的情況下，使用植物油部分替代大黃魚飼料中的魚油對大黃魚生長無顯著影響，但會顯著影響大黃魚肌肉脂肪酸組成[12-13]。而目前已證實的魚類HUFA生物合成關(guān)鍵酶主要有Δ6-Fad、Δ5-Fad、Elovl5、Elovl4、Elovl2等[14-15]，推測上述關(guān)鍵酶活力低下或基因表達(dá)的缺失可能是造成魚類自身合成HUFA能力不足的原因。為了解大黃魚對低魚粉低魚油飼料的耐受性和適應(yīng)程度，本研究利用無魚油無魚粉飼料(fish meal and fish oil free diet,FMFOFD)飼養(yǎng)大黃魚幼魚，觀察和測定了不同個體間生長差異情況、體組織脂肪酸組成，生長差異個體中HUFA合成相關(guān)基因表達(dá)水平，以期為選育出飼料轉(zhuǎn)化率高且節(jié)省飼料中魚油魚粉用量的大黃魚品系提供依據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 研究飼料的制備

本研究用的無魚粉無魚油飼料(配方見表1)是以酪蛋白為蛋白源(河南明瑞化工有限公司，純度：92%～95%)，以大豆油(益海嘉里(安徽)糧油工業(yè)有限公司)、亞麻籽油(內(nèi)蒙古錫林郭勒盟紅井源油脂有限責(zé)任公司)、豬油(精煉食用豬油，廈門禾昌晟生物科技有限公司)為脂質(zhì)源配制而成的。所有飼料原料經(jīng)粉碎后過60目篩，按原料量由少到多逐級混合均勻，待與油脂充分混合后再加水?dāng)嚢瑁蛊涑浞纸?，然后用雙螺桿擠條機(jī)制作成直徑約為2 mm的顆粒飼料，經(jīng)60 ℃烘箱烘干1 h，再待自然風(fēng)干后封口保存于-20 ℃冰箱中備用。另外，對照組采用福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的健馬牌大黃魚配合飼料(commercial diet,CMD，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.38%，粗脂肪為11.23%)飼養(yǎng)。

表1 飼料配方與營養(yǎng)組成Tab.1 Formulationandproximatecompositionsofexperimentaldietforlargeyellowcroaker飼料成分Ingredients質(zhì)量分?jǐn)?shù)Massfraction/%酪蛋白Caseinprotein40.0小麥粉Wheatflour20.0明膠Gelatin10.0預(yù)糊化淀粉Pregelatinizedstrach8.5豬油Lardoil6.0亞麻籽油Linseedoil4.0大豆油Soybeanoil2.0多維Multivitamin2.0多礦Multimineral2.0磷酸二氫鈣Monocalciumphosphate2.0氯化膽堿Cholinechloride2.0硫代甜菜堿Dimethylpropiothetin0.5牛磺酸Taurine1.0粗蛋白Crudeprotein46.16粗脂肪Crudefat13.81粗灰分Crudeash5.60

1.2 實驗魚處理

實驗用的大黃魚幼魚由寧德市金玲水產(chǎn)科技有限公司提供。實驗開始前，先將大黃魚幼魚從海上網(wǎng)箱移入室內(nèi)水泥池(3 m×3 m×1.5 m)中暫養(yǎng)1周，期間投喂健馬牌大黃魚配合飼料進(jìn)行馴化，直至能完全攝食配合飼料。按體重大小將幼魚分成6個不同的實驗組后，移入2 m×1 m×1 m(水深0.8 m)的小池中進(jìn)行無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)實驗；余下(未作分選)的幼魚作為對照組繼續(xù)用商品飼料CMD喂養(yǎng)。

1.3 飼養(yǎng)管理和飼養(yǎng)條件

幼魚暫養(yǎng)馴化和正式實驗期間均每天投喂兩次(8:30、15:30)，飼料顆粒大小根據(jù)魚體大小進(jìn)行調(diào)整，投喂至幼魚不再攝食則停止投餌。實驗期間，海水的溫度為(25±2)℃，鹽度為30～35，溶解氧維持在5 mg/L以上，每天吸污(換水量為100%)。

1.4 樣品采集和處理

飼養(yǎng)實驗結(jié)束時，先對實驗魚饑餓處理24 h，再用丁香酚進(jìn)行麻醉后才分別測量魚體重和體長。剪取每尾大黃魚的胸鰭，置于95%的酒精中，-20 ℃保存，用于DNA的提取；解剖魚體取腦、肝臟、胃、腸和肌肉組織，置于RNA保護(hù)液中，-80 ℃保存，用于RNA 的提?。蝗?nèi)臟團(tuán)、肌肉和肝臟組織，分別用錫箔紙包好后用自封袋封裝，-20 ℃保存，用于日后營養(yǎng)成分分析。

1.5 樣品測定及數(shù)據(jù)分析

樣品的粗蛋白含量采用凱氏定氮法測定，粗脂肪采用Folch氯仿-甲醇法[16]測定。組織樣品中脂肪酸含量的測定方法為：將提取的總脂肪，采用三氟化硼進(jìn)行脂肪酸甲酯化，然后用安捷倫7850氣相色譜儀對脂肪酸進(jìn)行分析。儀器條件設(shè)置為：前進(jìn)樣口250 ℃；柱箱250 ℃；柱流量1.25 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比為50∶1。梯度升溫程序為：50 ℃，2 min；再5 ℃/min，從50 ℃上升到270 ℃；270 ℃，2 min。采用面積歸一法進(jìn)行脂肪酸含量的定量分析。

1.6 熒光定量PCR

無魚粉無魚油飼料喂養(yǎng)的實驗組生長快個體、生長慢個體和以普通飼料喂養(yǎng)的對照組大黃魚各10尾，分別取其腦、肝、肌肉、胃、腸組織樣品進(jìn)行分析。

1)RNA的提取。RNA提取試劑盒購買自北京全式金生物技術(shù)有限公司。取50 mg左右組織進(jìn)行總RNA的提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后用超微量分光光度計測定RNA最終濃度及純度。

2)qRT-PCR反應(yīng)。用DNase Ⅰ對提取的大黃魚RNA樣品進(jìn)行處理后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTM Reverse Transcription System(Promega,USA)進(jìn)行下一步的處理。PCR反應(yīng)程序為：25 ℃，5 min;42 ℃，90 min;70 ℃，15 min。反應(yīng)結(jié)束后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)引物設(shè)計與合成。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的大黃魚基因序列，設(shè)計特異性引物，以β-actin為內(nèi)參基因。所有引物(見表2)均由北京華大基因有限公司合成。

表2 本研究使用的qRT-PCR引物序列和退火溫度

PCR反應(yīng)體系共包含正向引物(10 μmol/L)0.5 μL，反向引物(10 μmol/L)0.5 μL，大黃魚cDNA模板4 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix Ⅰ Gene 10 μL，SYBR Green Realtime PCR Master Mix Ⅱ H20 Grade 5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，各基因退火溫度20 s，72 ℃ 25 s(45個循環(huán))；81 ℃熒光采集5 s。熔解曲線的反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后，由羅氏定量PCR儀系統(tǒng)自帶軟件繪制基因的溶解曲線和計算擴(kuò)增效率，分析獲得各個樣品的CP值，并采用2-ΔΔCT法以β-actin的表達(dá)量來對樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理?；虮磉_(dá)水平等于各組織表達(dá)平均值±各組織表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值(mean±m(xù)ean of standard error，M±SEM)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計處理,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示。對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，顯著性水平為 0.05，若差異顯著用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚的生長與存活率

用無魚粉無魚油飼料喂養(yǎng)的大黃魚的生長和存活情況見表3。其中第2組(初始體重為2.00～2.25 g)由于在實驗期間受到病害感染，在實驗開始的第40天出現(xiàn)大量死亡，至第42天全部死亡。由表3可見，用無魚粉無魚油飼料喂養(yǎng)的大黃魚幼魚仍有部分個體能夠正常存活并以較快的速度生長。各組內(nèi)幼魚的初始體重差異不大，最大個體與最小個體體重差別不超過10%，但結(jié)束時則體重差異很大，當(dāng)時間超過60 d后，各組最大個體體重均達(dá)到最小個體的3倍以上，其中1、3、6三組最大個體體重均達(dá)到最小個體的4.2倍以上(見表3)。

表3 大黃魚幼魚生長與存活結(jié)果

除實驗組2之外的其他實驗組均有觀察到部分實驗魚因不能適應(yīng)實驗飼料而陸續(xù)死亡，這些死亡個體并未發(fā)現(xiàn)被病原體感染的癥狀，解剖可以觀察到其肝臟與正常肝臟組織相比顏色較白且易碎。實驗結(jié)束時對部分魚進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)生長快的個體外部形態(tài)與內(nèi)部構(gòu)造都正常，與用普通商品飼料喂養(yǎng)的個體無異，但生長最慢(尤其是第6組中最終體重比初始體重還小)的個體，盡管外部形態(tài)看不到明顯異常，但其肝臟也出現(xiàn)明顯的發(fā)白、易碎癥狀。

2.2 無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚的肌肉脂肪酸組成

實驗組4(初始體重4.25～4.75 g)中生長速度不同的3類個體的肌肉脂肪酸組成與含量見表4。從表4中可見，用商品飼料飼養(yǎng)的大黃魚的肌肉中∑SFA和HUFA的含量顯著高于用無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚(P<0.05)，而∑PUFA含量則顯著低于無魚粉無魚油組(P<0.05)。用無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚生長快個體肌肉中，∑MUFA、HUFA含量和DHA/EPA比例低于生長慢及中等個體；DHA含量顯著低于生長慢及中等個體(P<0.05)；而∑PUFA含量則較高，其中EPA含量顯著高于生長慢個體(P<0.05)。

3) 由于港口費率的不同，各港口城市投資港口的產(chǎn)出效率有所差異。當(dāng)競爭者的投資能力低下時，降低港口使費并不是好的策略。

表4 大黃魚肌肉脂肪酸組成

2.3 大黃魚HUFA合成相關(guān)基因的表達(dá)水平

用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了無魚粉無魚油飼料喂養(yǎng)的第4組(4.25～4.75 g)中極大(生長快)、極小(生長慢)個體和以普通飼料喂養(yǎng)的對照組大黃魚腦、肝、腸、胃和肌肉中Δ-6Fad、Elovl1、Elovl5、Elovl6四個與HUFA合成相關(guān)基因的表達(dá)情況。

2.3.1 Δ6-Fad基因

大黃魚Δ6-Fad各組織表達(dá)結(jié)果如圖1所示。其主要在腦和肝臟中表達(dá)，而以腦中表達(dá)量較多，在腸中也有痕量表達(dá)，在胃與肌肉中未檢測到其表達(dá)。與商品飼料飼養(yǎng)的大黃魚(對照組)相比，無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚幼魚，生長快個體的Δ6-Fad的表達(dá)量顯著升高，尤其是在腦中表達(dá)量約為對照組的5.5倍(P<0.05)，肝臟中Δ6-Fad的表達(dá)量約為對照組的1.8倍(P>0.05)；生長慢的個體Δ6-Fad的表達(dá)量也比對照組高，但在腦和腸中的表達(dá)水平與對照組差異不顯著(P>0.05)，在肝臟中的表達(dá)水平與對照組差異顯著(P<0.05)。無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚幼魚生長快與生長慢的個體相比，前者腦中Δ6-Fad的表達(dá)量約為后者的3.3倍，差異顯著(P<0.05)；在肝中的表達(dá)量生長快的則略低于生長慢的個體，但差異不顯著(P>0.05)。

2.3.2Elovl5基因

大黃魚各組織Elovl5的表達(dá)量如圖2所示。其在腦、肝臟、胃、腸和肌肉中都有表達(dá)。商品飼料飼養(yǎng)的大黃魚以腦中表達(dá)量較高，其次是肝、胃、腸，肌肉中表達(dá)量最少。與對照組大黃魚相比，無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚幼魚，生長快的個體肝臟與肌肉中Elovl5的表達(dá)量都顯著升高(提高到2倍以上，P<0.05)，胃與腸中的表達(dá)量也有升高但差異不顯著(P>0.05)，腦中Elovl5的表達(dá)量則與對照組基本一致，其表達(dá)量大小順序是：肝>腦>胃>腸>肌肉；而生長慢的個體檢測的5個組織中Elovl5的表達(dá)量都高于對照組，其中以胃中升高最顯著(P<0.01)，肝和肌肉中升高的幅度也達(dá)到顯著水平(P<0.01)，腦和腸中的表達(dá)水平雖比對照組高但差異不顯著(P>0.05)，其表達(dá)量大小順序是：腦>肝>胃>肌肉>腸。無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚幼魚生長快與生長慢的個體相比，前者以肝臟中表達(dá)量最高且兩者之間差異顯著(P<0.05)，后者則是腦中的表達(dá)量最高。

大黃魚各組織Elovl6基因的表達(dá)量見圖3。其在腦、肝臟、胃、腸和肌肉中都有表達(dá)，但表達(dá)量都很低。與對照組相比，無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚幼魚各組織中Elovl6基因的表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，除肌肉組織外，其他各組織中的升高幅度都達(dá)到20倍以上，特別是在腦和肝臟中的表達(dá)量很高。尤其是生長快的個體，肝臟與腦中Elovl6的表達(dá)量均高于生長慢個體，其中肝臟中兩者之間的差異顯著(P<0.05)。生長快個體Elovl6的表達(dá)量大小順序是：肝>腦>胃≈腸>肌肉，以肝臟表達(dá)量最高；而生長慢的個體Elovl6表達(dá)量大小順序則是：腦>肝>胃≈腸>肌肉，以腦中表達(dá)量最高。

2.3.4Elovl1基因

大黃魚各組織Elovl1基因表達(dá)量如圖4所示，其在腦、肝臟、胃、腸和肌肉中都有表達(dá)。對照組大黃魚Elovl1基因以腦中表達(dá)量最高，其次是肝臟、腸、肌肉，胃中表達(dá)量最低。與對照組相比，無魚粉無魚油飼料飼養(yǎng)的大黃魚幼魚除了肌肉以外其余4種組織中Elovl1基因的表達(dá)量都有不同程度的升高：生長快的個體腦中Elovl1的表達(dá)量升高到3倍以上，胃中的表達(dá)量升高20倍以上，腸中表達(dá)量升高的幅度也達(dá)到顯著性差異水平(P<0.05)，肝臟的表達(dá)量也有明顯升高但與對照組差異不顯著；生長慢個體各組織(肌肉除外)Elovl1的表達(dá)量雖有升高，但與對照組比較差異都不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 無魚油無魚粉飼料對不同大黃魚幼魚生長和存活的影響

本研究對體重介于1.75～5.75 g的1925尾大黃魚幼魚，進(jìn)行了無魚粉無魚油飼料喂養(yǎng)實驗，其中第2組(2.00～2.25 g)幼魚在飼養(yǎng)至第6周時突然暴發(fā)嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病而大量死亡，至第42天存活個體只剩下11.7%且活力明顯不佳，因而提前中斷該組實驗。其余各組經(jīng)過9～10周實驗，都得到了相似的結(jié)果，即：各組都有部分幼魚因為不能適應(yīng)所用的飼料而死亡，死亡的個體肝臟普遍發(fā)生了明顯的病變；各組存活的個體變得大小差異很大，各組最大個體體重是同組最小個體的2.8倍至4.6倍(見表3)；有些個體幾乎完全沒有生長，甚至實驗結(jié)束時體重比實驗初始時還小，這些生長慢或沒生長甚至負(fù)生長的個體肝臟也呈貧血狀，色淡、易碎，產(chǎn)生了異常，而生長快的個體則肝臟形態(tài)和顏色都表現(xiàn)正常。即使是中途中斷了實驗的第2組，第42天時仍存活的個體之間大小也出現(xiàn)顯著的差異，最大最小個體間體重差別(極差)已由實驗起始時的0.25 g擴(kuò)大為1.46 g，最大與最小個體間的體重比由1.125(2.25 g/2.00 g)上升為1.82(3.24 g/1.78 g)。

上述結(jié)果說明，同樣的飼料對不同的個體飼養(yǎng)的效果是不一樣的，大黃魚不同個體之間對無魚粉無魚油飼料的適應(yīng)性差異是非常大的。造成這種差異的原因，可能與不同個體間的營養(yǎng)感知[16]、對特定飼料的消化吸收能力(即飼料轉(zhuǎn)化率)，以及長鏈多不飽和脂肪酸和高不飽和脂肪酸的合成能力等因素有關(guān)，也與個體間的食物偏好性和營養(yǎng)需求差異有關(guān)[17]。魚粉和魚油是構(gòu)成大黃魚配合飼料成本的主要部分，隨著養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，魚粉和魚油供應(yīng)不足在未來可能成為制約肉食性海洋水產(chǎn)動物養(yǎng)殖規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大的因素。從本研究的結(jié)果看，利用養(yǎng)殖對象個體之間的遺傳差異，選育出對魚粉魚油需求量低，甚至完全不需要添加魚粉魚油的“耐粗飼”品系，從而降低養(yǎng)殖成本，減少對魚油魚粉的需求，這是完全可能的，并具有巨大的意義，值得引起充分重視。本研究也提示魚類(及其他肉食性水產(chǎn)動物)營養(yǎng)與飼料研究者，在進(jìn)行營養(yǎng)與飼料的相關(guān)研究時，需要充分考慮研究對象群體及個體之間的遺傳差異。

3.2 無魚粉無魚油飼料對大黃魚幼魚肌肉脂肪酸組成的影響

與對照組大黃魚脂肪酸組成相比較，可以發(fā)現(xiàn)攝食無魚粉無魚油飼料大黃魚肌肉的ΣSFA、ΣHUFA、DHA、EPA、AA含量明顯較低，ΣPUFA含量較高，但ΣMUFA含量變化不明顯。這與李經(jīng)奇等[12]用亞麻籽油和豆油替代魚油對大黃魚肌肉脂肪酸組成影響的研究結(jié)果一致。一般魚體的脂肪酸組成與飼料的脂肪酸組成正相關(guān)，攝食無魚粉無魚油飼料大黃魚幼魚魚體中PUFA含量高的原因與飼料中使用亞麻籽油和大豆油替代魚油有關(guān)。亞麻籽油中含有豐富的LA、ARA、ALA，導(dǎo)致實驗魚體中的LA、ARA含量明顯升高，這在大菱鲆[18]的亞麻籽油替代魚油的實驗中也得到證實。

在脊椎動物中HUFA的生物合成是通過脂肪酸去飽和酶(Fads)和延長酶(Elovl)催化完成的。經(jīng)過連續(xù)的去飽和及延長反應(yīng)，將LA和ALA合成為DHA和EPA等高度不飽和脂肪酸[19]。海水魚類的高不飽和脂肪酸合成調(diào)控機(jī)制與大多數(shù)脊椎動物一致。但不同魚類的HUFA合成能力差異明顯，一般認(rèn)為淡水魚類和溯河洄游的鮭鱒魚類能夠依靠自身的作用將LA和ALA轉(zhuǎn)化為HUFA，而在對海水魚類如真鯛、大菱鲆等HUFA合成機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，由于關(guān)鍵性的去飽和酶活性較低或極低，使其將LA和ALA轉(zhuǎn)化為HUFA的效率極低而不能滿足自身需要[20-21]。另外，海水魚的天然食物中富含HUFA，不需要自身額外合成，導(dǎo)致相關(guān)HUFA合成基因的表達(dá)量降低、功能退化甚至消失[22-23]，推測這是導(dǎo)致攝食無魚粉無魚油飼料大黃魚魚體EPA、DHA等HUFA明顯低于對照組的原因。同時對4.25～4.75 g組內(nèi)大黃魚體重極端大和極端小的個體脂肪酸含量的相互比較也可以發(fā)現(xiàn)，大黃魚生長較快的個體中ALA、ARA和PUFA含量均明顯高于生長較慢個體，提示脂肪酸的吸收利用效率與大黃魚的生長密切相關(guān)，但飼料中缺乏HUFA的情況是否在一定程度上激發(fā)了大黃魚自身的HUFA合成能力，還需要結(jié)合大黃魚HUFA合成相關(guān)基因的表達(dá)情況作進(jìn)一步探討。

3.3 無魚粉無魚油飼料對生長差異大黃魚幼魚HUFA合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

本研究采用熒光定量PCR方法，對攝食無魚粉無魚油飼料生長快和生長慢的大黃魚，以及攝食商品飼料大黃魚組織中的4種脂肪酸合成酶基因表達(dá)情況進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示4個基因在攝食無魚粉無魚油飼料大黃魚幼魚特定組織中的表達(dá)量都有不同程度的提高，特別是生長快的個體其Δ6-Fad和Elovl5表達(dá)水平的升高較顯著，這與李經(jīng)奇等[12]的研究結(jié)果一致。在有關(guān)海水魚類Δ6-Fad的營養(yǎng)調(diào)控研究[24]中發(fā)現(xiàn)，金頭鯛(Sparusaurata)Δ6-Fad的兩種轉(zhuǎn)錄本都被富含HUFA的飼料所抑制；相反，用菜籽油和豆油完全替代魚油飼喂金頭鯛幼魚，不僅顯著提高了魚體的18:2n-9和18:3n-6含量，而且Δ6-FadmRNA的表達(dá)量也提高了6倍。在對大西洋鮭(Salmosalar)的研究[25]中發(fā)現(xiàn)，大豆油組魚肝細(xì)胞Δ5-Fad和Δ6-Fad基因的相對表達(dá)量均顯著高于魚油組[31]，Δ6-Fad是魚類HUFA生物合成的第一限速酶[26]，提示富含十八碳脂肪酸的植物油可能比富含DHA和EPA的魚油更能促進(jìn)魚體對特定脂肪酸如HUFA的去飽和過程。

Elovl5碳鏈延長酶基因在海水魚類中廣泛存在，在從C18至C20 PUFA合成中碳鏈的延長酶發(fā)揮重要作用，且一般認(rèn)為海水魚中Elovl5的活性較高。有研究[27]表明n-3HUFA對大黃魚Elovl5和Elovl4基因的表達(dá)有抑制作用。本研究的商品飼料中由于添加了大量魚粉和魚油，含有充足的HUFA可供直接吸收利用，不需要魚類自身合成，因此對照組中這些基因的表達(dá)量較低，而實驗組中HUFA合成相關(guān)基因的表達(dá)量上升也證實了大黃魚自身具有一定的HUFA合成能力，且相關(guān)基因受外界營養(yǎng)條件的影響和調(diào)控。

此外，本研究的結(jié)果顯示攝食無魚粉無魚油飼料大黃魚幼魚組織中Elovl1和Elovl6的表達(dá)量也顯著上升。目前海水魚類研究較多的是Elovl5、Elovl2等延長酶基因，關(guān)于Elovl1和Elovl6的報道甚少。Elovl1主要催化形成C12:0、C14:0、C16:0[28]，Elovl6在C18:0和C18:1的催化生成中起重要作用[29]。本研究在無魚粉無魚油飼料中延長酶的作用底物充足，因此Elovl1和Elovl6基因表達(dá)量顯著增加，進(jìn)一步證實了營養(yǎng)條件會影響HUFA合成基因的表達(dá)，相關(guān)基因的表達(dá)又促進(jìn)了魚類對特定脂肪酸的吸收利用。上述基因表達(dá)模式的差異可能與實驗魚個體出現(xiàn)的生長差異密切相關(guān)，但是否是引起魚體生長差異的主要原因以及其作用機(jī)理如何，后續(xù)需要利用基因組學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)手段加以深入研究。

4 結(jié)論

本研究以混合油脂(m(大豆油)∶m(亞麻籽油)∶m(豬油)=2∶1∶1)替代魚油，明膠和酪蛋白替代魚粉制成的無魚粉無魚油配合飼料，對大黃魚幼魚進(jìn)行為期70 d的養(yǎng)殖。結(jié)果表明：攝食無魚粉無魚油飼料的大黃魚幼魚能夠正常存活，但不同個體之間的生長差異顯著；ΣHUFA、DHA、EPA、AA含量明顯較低，ΣPUFA含量較高；生長快與生長慢個體的Δ6-Fad、Elovl5、Elovl6和Elovl1的表達(dá)模式即組織表達(dá)譜均存在明顯的差異，生長快個體腦中Δ6-Fad和Elovl1、肝中Elovl5和Elovl6的表達(dá)量顯著高于生長慢個體。這說明大黃魚幼魚早期營養(yǎng)調(diào)控可以有效調(diào)節(jié)魚體HUFA合成能力以及對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。本研究結(jié)果為今后改善大黃魚幼魚飼料配方，降低飼料成本，提高養(yǎng)殖效益具有重要的意義。