PRL對HC11細胞乳蛋白及其調(diào)節(jié)因子基因表達的影響

田青,A.J.Spitzer,Feng-Qi Zhao

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 淮安223003；2.佛蒙特大學(xué) 伯靈頓05405）

0 引言

牛奶蛋白主要包括αs1-酪蛋白（CSN1S1）、αs2-酪蛋 白（CSN1S2）、β-酪 蛋 白（CSN2）和κ-酪 蛋 白（CSN3）、乳清蛋白（α-LA）和乳球蛋白(β-LG)等。在泌乳過程中，奶牛乳腺上皮細胞(MECs)需要先從血液中攝取能量、葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，然后在泌乳激素、信號通路、細胞因子等的調(diào)節(jié)下才能完成，如乳葡萄糖的轉(zhuǎn)運需要葡萄糖轉(zhuǎn)運子（GLUT1和GLUT8）的調(diào)節(jié)[1]，泌乳激素作用的發(fā)揮需要有激素受體的調(diào)節(jié)[2-3]，乳腺健康的保持還有炎癥因子的參與等[4]。研究表明，在妊娠晚期到泌乳早期，乳腺上皮細胞中GLUT1和GLUT8基因的表達會顯著上調(diào)[5]，由LPS引發(fā)的大鼠乳腺上皮細胞(MMECs)導(dǎo)致各種細胞因子的表達，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和IL-1β[6]。催乳素（PRL）是促進乳腺發(fā)育和維持乳腺正常形態(tài)的重要激素，因此它被視為在體外促進乳腺上皮細胞生長和形態(tài)維持的重要激素之一。為了了解PRL本身對乳腺上皮細胞酪蛋白合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運子及炎癥因子的影響，進而排除它對后續(xù)開展的體外試驗研究的干擾，本試驗以HC11細胞為載體，研究了PRL對乳腺上皮細胞中主要乳蛋白基因(CSN1S1、CSN2、α-LA)、葡萄糖轉(zhuǎn)運因子（GLUT1和GLUT8）和炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞模型

HC11細胞，來自于妊娠中期BALB/c大鼠的細胞系，由美國佛蒙特大學(xué)趙鳳啟教授實驗室提供。

1.2 細胞增殖

采用隨機分組試驗設(shè)計，設(shè)對照（無激素）和試驗組（5 ug/mL的催乳素），每組2個重復(fù)，每個重復(fù)4個孔，實驗重復(fù)4次。

將復(fù)蘇后的HC11細胞以6×103個/孔等密度接種于96孔板，先用生長培養(yǎng)基(CGM：RPMI1640+10% FBS+50 ug/mL gentamicin+5 ug/mL insulin+10 ng/mL EGF)培養(yǎng)至80%貼壁，然后用前激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PIM：RPMI1640+10% charcoal-treated horse serum+50 ug/mL gentamicin+5 ug/mL insulin)培養(yǎng)24 h后，試驗組隨后接著用激素誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PIM+0.1μmol/L dexamethasone+5 mg/mL prolactin)培 養(yǎng)20 h（對照組接著用PIM培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h），之后每孔細胞加入10 mL MTT標(biāo)記試劑培養(yǎng)4 h后立刻加入增溶試劑100μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀570 nm讀取吸光度。

1.3 激素誘導(dǎo)試驗

為了確定催乳素是否對HC11細胞蛋白質(zhì)相關(guān)基因、葡萄糖轉(zhuǎn)運因子和細胞因子基因表達具有誘導(dǎo)作用，試驗采用隨機分組試驗設(shè)計（同細胞增殖試驗設(shè)計），分別研究了催乳素作用3 h和24 h對各基因表達的影響。具體方法同細胞增殖試驗，即HC11細胞以2×105個/孔等密度接種于6孔板，即先用生長培養(yǎng)基(CGM)培養(yǎng)至細胞80%貼壁，然后用前PIM培養(yǎng)24 h，隨后用PIM和（PIM+5 mg/mL）分別培養(yǎng)對照組和試驗組細胞3 h和24 h后收獲細胞，用于測定各基因表達?？俁NA的提取采用RNeasy Plus Kit(Qiagen)試劑盒并按說明書進行，RNA的轉(zhuǎn)錄采用SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase(Invitrogen)試劑盒并按說明書進行，以GAPDH、β-actin和HPRT為內(nèi)參，采用SYBR green試劑盒并按說明書對各基因mRNA表達量進行分析，基因表達量用2^(-△△CT)法進行計算。各個基因引物詳見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有原始數(shù)據(jù)用SAS 9.1中TUKEY單因素方差分析進行數(shù)據(jù)處理。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

大鼠乳腺上皮細胞模型是體外研究泌乳、乳成分合成、炎癥影響及其作用機制等的重要依據(jù)，本試驗以大鼠HC11細胞系為載體，研究了PRL對大鼠乳腺上皮細胞增殖、乳蛋白合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運因子及炎癥因子各基因表達的影響，為后續(xù)實驗研究中試驗條件的設(shè)定提供了重要的參考。

2.1 催乳素對HC11細胞增殖的影響

由圖1可見，與對 照組相比，5mg/mL的PRL對HC11細胞的增殖無影響（P＞0.05）。眾所周知，催乳素(prolactin，PRL)是一種分子量為23 ku的單鏈多肽，是由腦垂體分泌的，它最著名的作用是針對乳腺的，其主要功能包括泌乳的起始和維持，以及調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育和分化的[11]。2014年田青等人研究發(fā)現(xiàn)，催乳素對奶牛乳腺上皮細胞的增殖具有促進作用，并且隨著催乳素劑量的增加呈先上升后下降的趨勢，其中50 ng/mL的劑量促乳腺上皮細胞的增殖作用最為明顯[12]。在本研究中，與對照相比，催乳素對細胞增殖的影響差異不顯著，主要原因可能是催乳素添加劑量較小造成的。

表1 基因引物信息表

圖1 催乳素對HC11細胞增殖的影響

2.2 催乳素對HC11細胞中乳蛋白基因表達的影響

由圖2可見，與對照組相比，作用3 h時，催乳素顯著促進了HC11細胞中β-CN和α-LA基因的表達（P＜0.05），αS1-CN基因的表達也明顯增加（約20倍）但差異不顯著（P＞0.05）；但當(dāng)催乳素作用于大鼠乳腺上皮細胞24 h時，與對照組相比，催乳素顯著增加了HC11細胞αS1-CN，β-CN和α-LA基因的表達（P＜0.05）。從時間效應(yīng)來看，隨著催乳素誘導(dǎo)時間的延長，激素對乳蛋白相關(guān)基因的誘導(dǎo)作用也增加明顯，24 h時蛋白基因的表達量顯著高于3 h的表達量（P＜0.05）（見圖3）。

圖2 3 h時催乳素對相關(guān)酪蛋白基因表達的影響

本試驗結(jié)果表明，用5 mg/mL的催乳素處理HC11細 胞3 h和24 h均 誘 導(dǎo)αS1-CN、β-CN和α-LA基因的表達（除3 h時CSN1S1基因表達量增加了約20倍以外，其他各組均達到了顯著水平P＜0.01)，說明催乳素對酪蛋白相關(guān)基因的表達有顯著的誘導(dǎo)作用，也間接說明了在泌乳和乳蛋白合成過程中，催乳素發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。杜瑞平等研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)液含瘦素100 ng/mL基礎(chǔ)上,催乳素對乳蛋白及信號通路關(guān)鍵因子基因表達有促進作用,但濃度限制在一定范圍(0.1～1.0μg/mL),過高或過低都會呈現(xiàn)抑制效應(yīng)[13]。這與本試驗結(jié)果有相同又有不同，相同的是催乳素的確可以促進酪蛋白基因的表達，不同的是劑量效應(yīng)上略有差異，這可能是杜瑞平等的實驗研究中使用了瘦素的原因。激素之間往往關(guān)系緊密，相互影響，有的拮抗，有的協(xié)同，因此兩種激素同時存在可能會使結(jié)果有一定的差異。也有其他一些研究表明，泌乳激素復(fù)合物（INS、PRL和GCs）可以誘導(dǎo)β-CN和α-LA基因表達，這也和本試驗的研究結(jié)果一致。本試驗研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，催乳素誘導(dǎo)乳蛋白合成具有時間效應(yīng)關(guān)系，隨著催乳素誘導(dǎo)時間的延長，激素對乳蛋白相關(guān)基因的誘導(dǎo)作用也增加明顯，24 h時蛋白基因的表達量顯著高于3 h的表達量（P＜0.05）。

圖3 24 h時催乳素對酪蛋白基因表達的影響

2.3 催乳素對HC11細胞中GLUTs基因表達的影響

圖4 3 h時催乳素對葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子基因表達的影響

由圖4可見，與對照組相比，作用3 h時，催乳素有增加GLUT1和GLUT8基因表達的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）；但作用24 h時，催乳素對GLUTs基因表達依然無影響（P＞0.05），但和3 h時相比，GLUT1基因表達量上升程度要比GLUT1快（圖5）。宗燦華等研究結(jié)果表明，GLUT1是一個隨泌乳期的變化而動態(tài)變化的基因。該基因的表達妊娠期開始升高，整個泌乳期持續(xù)高表達，泌乳140 d達到峰值，此后開始下降。妊娠晚期和泌乳期，GLUT1主要定位在乳腺上皮細胞基底側(cè)細胞膜和頂膜，這說明奶牛乳腺主要通過GLUT1吸收葡萄糖為乳腺發(fā)育和泌乳提供能量和底物[14]，這與本試驗的研究結(jié)果一致。但也有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠乳腺上皮細胞系HC11或牛原代乳腺上皮細胞中，GLUTs的表達并沒有隨著泌乳激素處理而增加，但泌乳激素卻明顯刺激乳蛋白和脂質(zhì)基因的表達[15]，這更加證實了催乳素調(diào)控泌乳和乳蛋白合成與分泌的功能。

圖5 24 h時催乳素對葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子基因表達的影響

圖6 3 h時催乳素對細胞因子基因表達的影響

圖7 24 h時催乳素對細胞因子基因表達的影響

2.4 催乳素對HC11細胞中細胞因子基因表達的影響

由圖6可見，與對照組相比，3 h時催乳素有降低細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α基因表達的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）；由圖7可見，隨著催乳素作用時間的延長，與對照組相比，24 h時催乳素對細胞因子的基因表達無影響（P＞0.05）。從時間效應(yīng)來看，隨著催乳素誘導(dǎo)時間的延長，各細胞因子基因表達也在下降。

眾所周知，TNF-α是由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生的一種細胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，具有調(diào)節(jié)機體免疫和介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)、組織損傷、休克等生理性和病理性反應(yīng)雙重作用，細菌和病毒入侵可以誘導(dǎo)機體表達過量TNF-α，IL-6主要由成纖維細胞、角質(zhì)細胞、單核巨噬細胞及T淋巴細胞產(chǎn)生[16]。IL-1β又稱淋巴細胞活化因子，也是由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生，在組織炎癥狀態(tài)下發(fā)揮著重要功能。IL-6它可以誘導(dǎo)B淋巴細胞和T淋巴細胞增殖分化，增強自然殺傷（NK）細胞和細胞毒性T淋巴（CTL）細胞的活性參與炎癥反應(yīng)[17]。有研究結(jié)果表明，不同濃度LPS刺激奶牛乳腺上皮細胞24 h后，細胞中IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA相對表達水平隨著LPS刺激濃度的增加而增加，說明IL-1β、IL-6在炎癥反應(yīng)中會被激活以起到抗炎作用[18]。這看似與本試驗中PRL對3種細胞因子表達的影響不符合，實際上也并不矛盾。在本試驗中，選用的是健康的大鼠HC11細胞，催乳素的添加只是模擬了動物泌乳過程中體內(nèi)激素的正常生理變化，而各細胞因子的高表達主要體現(xiàn)在炎癥狀態(tài)下的抗炎作用的體現(xiàn)，此試驗中的大鼠健康乳腺中本就不該有細胞因子的高表達，因此說明本試驗研究的結(jié)果是可信的。

3 結(jié)論

5 mg/mL的催乳素不影響細胞增殖和炎癥因子的基因表達，但顯著誘導(dǎo)了乳蛋白基因的表達，說明催乳素誘導(dǎo)的HC11細胞模型更適合于對乳蛋白合成和分泌有負面影響因素及作用機制研究，否則則需要排除PRL干擾。