采用毛細管凝膠電泳技術(shù)檢測常見乳源成分

劉鳴暢,王洪越,方舒正,李唯熙,楊艷歌,吳亞君

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京100176；2.河北工程大學(xué)，河北邯鄲056038）

0 引言

2018年《國務(wù)院辦公廳關(guān)于推進奶業(yè)振興保障乳品質(zhì)量安全的意見》[1]中提出，積極發(fā)展乳肉兼用牛、奶水牛、奶山羊等其他奶畜生產(chǎn)，進一步豐富乳源結(jié)構(gòu)。并且，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等九部委聯(lián)合印發(fā)《關(guān)于進一步促進奶業(yè)振興的若干意見》[2]明確指出要重視開發(fā)羊乳、水牛乳等特色乳制品。驢乳、馬乳、駱駝乳、水牛乳、牦牛乳、羊乳等作為市場上的主要特色乳品，近年來得到了良好的發(fā)展，產(chǎn)量均呈上升趨勢[3-5]。

相關(guān)研究表明，特色乳因其蛋白結(jié)構(gòu)與牛乳蛋白存在差異，所以致敏性較低[6-7]，特別是對于體弱的嬰幼兒和老年人。Caballos等[8]研究表明與牛乳蛋白相比，山羊奶蛋白更易消化且致敏性較低；Egito等[9]研究認為馬乳可以大大緩解消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病癥狀；駱駝乳對于Ⅰ型糖尿病患者的微量白蛋白尿癥狀有明顯的輔助治療作用；此外，驢乳乳清蛋白含量較高，更接近于母乳乳清蛋白含量，是作為一段嬰幼兒配方乳粉的優(yōu)質(zhì)原料[10-12]。但由于驢、馬、羊、駱駝等動物產(chǎn)奶率較低，所以特色乳品的售價較高，在經(jīng)濟利益驅(qū)動下，以牛乳摻假的現(xiàn)象較為常見。為保護消費者權(quán)益，確保乳源真實性，建立一個特色乳品乳源檢測的評價體系是十分必要的。

現(xiàn)有報道的特色乳品乳源檢測的方法主要有核酸檢測[13-14]、色譜質(zhì)譜分析[15-17]、蛋白質(zhì)檢測[18]、免疫檢測[19-21]等。不同的方法因其特點不同，應(yīng)用場合也有所差別。如核酸與免疫檢測，適用于一線及現(xiàn)場檢測，可實現(xiàn)大量樣本的初篩；質(zhì)譜和傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測技術(shù)在實驗室研究方面應(yīng)用更為廣泛。Ren等[22]研制ELISA檢測試劑盒，可實現(xiàn)對牦牛乳中牛乳成分的現(xiàn)場檢測；Calleja等[23]研制的實時熒光檢測試劑盒可對羊乳中牛乳成分進行快速檢測；Blasi等[24]通過對三?；视偷牧Ⅲw專一分析實現(xiàn)對驢奶、牛奶、綿羊奶、山羊奶和水牛奶的判定。Francisco等[25]通過元素含量測定結(jié)合函數(shù)計算，可對牛乳、山羊乳、綿羊乳進行很好的區(qū)分。

乳及乳制品中富含蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分析也是對乳品真?zhèn)巍⑵焚|(zhì)以及性狀研究的重要手段。有研究表明，各種乳品的蛋白質(zhì)在種類和含量上均存在一定差異[26]。毛細管凝膠電泳技術(shù)，在電壓的驅(qū)動下將蛋白根據(jù)分子量進行分離。筆者所在實驗室前期也采用毛細管電泳技術(shù)對乳品中的大豆蛋白成分[27]、羊乳嬰幼兒配方乳粉中的牛乳成分[28]均建立了檢測方法。說明毛細管凝膠電泳技術(shù)可以作為乳品真實性判別的重要手段。本研究采用毛細管凝膠電泳技術(shù)，通過篩選出驢乳、馬乳、駱駝乳、水牛乳、牦牛乳、牛乳、羊乳等多種乳的多個靶標蛋白峰，以及判定標準，形成系列評價體系，實現(xiàn)對常見乳源成分進行檢測。并考察該方法在穩(wěn)定性、重復(fù)性以及靈敏度等方面的參數(shù)，并對市售樣品的檢測情況，初步驗證了毛細管凝膠電泳技術(shù)作為多種特色乳品乳源檢測方法具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

標準樣品：水牛乳收集自廣西水牛研究所，馬乳和羊乳為實驗室派員前往內(nèi)蒙古收集，駱駝乳委托內(nèi)蒙古海關(guān)技術(shù)中心收集，牦牛乳、牛乳委托中國農(nóng)業(yè)大學(xué)收集，驢乳委托山東海關(guān)技術(shù)中心收集；標準樣品均經(jīng)過實時熒光PCR檢測，確定其為標準樣品。市售乳制品購自北京某超市。

1.1.2 主要試劑

毛細管電泳儀SDS-MW試劑盒，美國Sciex；BCA蛋白定量試劑盒，德國Merck；β-巰基乙醇，美國Sigma-Aldrich。

1.1.3 主要設(shè)備

PA800 plus毛細管電泳儀，美國Sciex；及光電二極管陣列檢測器，PDA檢測器，美國Sciex；5418R冷凍離心機，德國Eppendorf；微量移液器，德國Eppendorf；超聲波清洗儀，國產(chǎn)；渦旋振蕩器，Genie公司；電子天平，Sar torius公司；水浴鍋。

1.2 蛋白濃度測定

使用BCA蛋白定量試劑盒測定對各乳品標準樣品及市售樣品進行蛋白含量測定。所有樣品重復(fù)3次。在酶標儀上560 nm讀數(shù)，制作標準曲線，并計算各樣品蛋白質(zhì)量濃度。

1.3 毛細管凝膠電泳方法

將樣品按照測定濃度將樣品稀釋至15 mg/mL，量取500μL液態(tài)乳樣品置于15 mL離心管中，加2%SDS樣品緩沖液7 mL，渦旋震蕩，至充分溶解。移液槍吸取稀釋后的樣品10μL于1.5 mL離心管中，加入1μL 10 ku內(nèi)標蛋白溶液、85μL SDS樣品緩沖液，并在通風(fēng)柜中加入5μLβ-巰基乙醇，蓋緊瓶蓋、充分混合，于沸水浴中加熱3 min，取出后用常溫水沖洗冷卻30 s，上樣電泳分析。毛細管柱為50μm×30.2 cm非涂層石英毛細管。電泳步驟幾及條件如表1所示，采用檢測器為光電二極管陣列(PDA)檢測器，在4℃條件下檢測，獲取數(shù)據(jù)。

表1 毛細管電泳步驟及條件

2 實驗結(jié)果

2.1 蛋白濃度測測定

測定牛乳、水牛乳、牦牛乳、驢乳、馬乳、羊乳、駱駝乳樣品的總蛋白濃度，每個樣品三次重復(fù)測定取平均值，發(fā)現(xiàn)駱駝乳、牦牛乳蛋白濃度較高，馬乳、驢乳蛋白濃度較低。為了保證不同乳品總蛋白濃度不對實驗結(jié)果造成影響，我們用蒸餾水對蛋白濃度大的乳樣品進行適量稀釋，使其蛋白濃度約為15 mg/mL，并進行總蛋白濃度測試，結(jié)果如表2所示。

表2 7種乳品蛋白濃度測定結(jié)果

2.2 不同乳品差異分析

2.2.1 不同乳品蛋白特征峰篩選

我們收集了真實屬性的牛乳、水牛乳、牦牛乳、驢乳、馬乳、羊乳、駱駝乳，采用優(yōu)化后的毛細管凝膠電泳方法對樣品的蛋白質(zhì)組分進行分析，每個樣品進行三次獨立重復(fù)實驗，以確保圖譜峰形穩(wěn)定可靠。結(jié)果如圖1所示。在馬乳和驢乳中，穩(wěn)定存在特征蛋白峰W3，而在其他乳品中均為出現(xiàn)，所以，W3可作為馬屬動物乳源特征蛋白峰。通過對牦牛乳、水牛乳、奶牛乳等牛屬動物電泳分析發(fā)現(xiàn)，3種乳中蛋白峰C4的相對遷移時間與其他乳不同，可作為牛屬動物的特征蛋白峰。W2蛋白峰在駱駝乳中含量極低，根據(jù)前期研究，W2蛋白位于乳清蛋白區(qū)域，結(jié)合文獻研究[29-30]，駱駝乳中缺乏β-乳球蛋白，所以可以初步判定W2即為β-乳球蛋白，該蛋白可作為駱駝乳摻假的參考指標。本課題組前期研究證明，C1蛋白，即為β-酪蛋白，是牛乳特征蛋白，與羊乳C1相對蛋白遷移時間不同，本實驗結(jié)果顯示，牛乳中該蛋白的相對遷移時間也與驢乳和馬乳中的不同。

同時，我們發(fā)現(xiàn)，分子量為14 ku左右的蛋白W1在兩種乳中均存在，根據(jù)分子量判別其為α-乳球蛋白（α-Lactalbumin,α-La）。駱駝乳中W1蛋白與W2蛋白的峰面積比值較大，牛乳中該峰面積比值較小。

圖1 牛乳、水牛乳、牦牛乳、驢乳、馬乳、羊乳、駱駝乳毛細管凝膠電泳圖譜

2.2.2 不同乳品差異因子分析

應(yīng)用SIMCA軟件，針對不同乳品主要蛋白的與10 ku內(nèi)標的相對遷移時間，以及蛋白峰W1與W2的比值進行聚類分析，結(jié)果如表3所示，采用主成分分析（PCA）對數(shù)據(jù)進行處理，構(gòu)建模型，結(jié)果如圖2所示。我們發(fā)現(xiàn)，馬乳和驢乳主要性質(zhì)相近，與其他乳差異較大，駱駝乳與其他乳差異也較大。通過差異因子分析，我們確定W1、W2峰面積比為駱駝乳特征因子；W3蛋白峰為馬乳和驢乳特征因子；C4蛋白相對遷移時間為牛屬乳品特征因子。

圖2 不同乳品差異因子PCA聚類分析模型

2.3 方法重復(fù)性及穩(wěn)定性

為考察毛細管凝膠電泳法的方法重復(fù)性與穩(wěn)定性，將牛乳標準樣品按照標準操作程序進行毛細管電泳，進行6次獨立重復(fù)試驗，以及單次試驗連續(xù)進樣6次，重復(fù)性實驗結(jié)果圖譜如圖3所示。對樣品圖譜進行積分，計算出峰時間。重復(fù)性試驗中，牛乳中15個蛋白峰與10 ku內(nèi)標蛋白出峰時間差值的相對標準偏差（Relative standard deviation,RSD）均不高于0.06。穩(wěn)定性試驗中，牛乳中15個蛋白峰與10 ku內(nèi)標蛋白出峰時間差值的RSD均不高于0.03。

圖3 牛乳蛋白毛細管電泳圖譜穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4 特色乳品檢測靈敏度

為考察所選定的三個特征蛋白峰的檢測靈敏度，由于牛乳成本最低，產(chǎn)量最大，為最主要摻假基質(zhì)，所以分別將相同濃度的驢乳與牛乳、駱駝乳與牛乳進行梯度配比，使牛乳的質(zhì)量分數(shù)分別為0%、5%、10%、50%、100%，進行毛細管凝膠電泳分析，并進行3次重復(fù)試驗。

2.4.1 驢乳中牛乳成分檢測靈敏度

不同配比梯度驢乳與牛乳摻比樣品結(jié)果如圖4所示，驢乳特征蛋白W3在樣品中穩(wěn)定存在，且不與牛乳蛋白發(fā)生重疊。但是牛乳特征蛋白C4的靈敏度較低，僅能檢測到在含牛乳比例不低于10%的樣品。但是，我們發(fā)現(xiàn)C1蛋白，在含5%牛乳的驢乳樣品中蛋白峰明顯，可作為判別驢乳和馬乳中含有牛乳的判別依據(jù)。

圖4 不同配比梯度的驢乳樣品毛細管凝膠電泳圖譜

表3 不同乳品蛋白峰與蛋白內(nèi)標相對遷移時間以及W1、W2蛋白峰峰面積比值結(jié)果

2.4.2駱駝乳中牛乳成分檢測靈敏度

不同配比梯度駱駝乳與牛乳摻比樣品結(jié)果如圖5所示，牛乳特征蛋白C4在樣品中穩(wěn)定存在，且不與駱駝乳蛋白發(fā)生重疊。但是駱駝乳中的牛乳特征蛋白C4靈敏度也較低，同樣是僅能檢測到在含牛乳比例不低于10%的樣品。同時，根據(jù)前期實驗結(jié)果，應(yīng)用軟件積分，計算W1和W1蛋白峰的峰面積，計算W1蛋白峰與W1蛋白峰的峰面積比值，結(jié)果如表4所示。牛乳W1與W1的峰面積比值為0.322，駱駝乳W1與W1的峰面積比值為3.907，線性相關(guān)系數(shù)為0.9975。

圖5 不同配比梯度的駱駝乳樣品毛細管凝膠電泳圖譜

表4 樣品中W1蛋白峰與W1蛋白峰的峰面積比值

2.5 市售樣品檢測

圖6 市售乳品毛細管凝膠電泳圖譜

我們從市場上購買了7個特色乳產(chǎn)品，按照建立的方法進行毛細管電泳檢測，結(jié)果如圖6所示?？梢?，山羊乳粉和羊乳粉樣品中未檢測到與牛乳C1蛋白相對遷移時間相同的蛋白，判定其為羊乳產(chǎn)品；馬乳乳飲料樣品中，蛋白峰峰形不明顯，推測其經(jīng)過了強熱加工處理，蛋白水解嚴重，但是未見與牛乳C1蛋白相對遷移時間相同的蛋白，W3蛋白位置有蛋白峰，所以，初步判定其為馬乳制品；駱駝配方乳粉中，可見與牛乳C1蛋白相對遷移時間相同的蛋白，經(jīng)積分計算，W1與W2的峰面積比值為1.278，判別其中含有牛乳成分，凍干驢乳粉中，W3蛋白峰明顯，并且未出現(xiàn)與牛乳C1蛋白相對遷移時間相同的蛋白，判定其為驢乳制品；牦牛乳和水牛乳樣品中，C1蛋白和C4蛋白相對遷移時間與?？苿游锶槠诽卣饕恢?，證明其為?？苿游锶橹破?。

3 討論

現(xiàn)在對于特色乳品的物種判別檢測方法的研究已經(jīng)成為乳品真?zhèn)渭捌焚|(zhì)研究的熱點，現(xiàn)在主要報道的檢測技術(shù)研究中，如Sachinandan等[31]采用單重和多重PCR法可對液態(tài)乳及乳酪中的水牛源與牛源成分進行檢測，檢測靈敏度可達0.1%，但是對于復(fù)雜基質(zhì)樣品或者混用生產(chǎn)線的乳制品容易造成假陽性。Hurley等[20]開發(fā)了一種基于間接競爭性ELISA法的牛乳成分快速檢測方法，可用于快速檢測羊奶、綿羊奶和水牛奶中的牛奶，檢測靈敏度可達0.1%。但是免疫技術(shù)過于依賴抗體質(zhì)量，現(xiàn)今，特色乳品種類越來越多，對于近源物種的乳品蛋白是否存在交叉反應(yīng)仍需進一步確認，而且對于特色乳品中的少量污染成分，以及復(fù)雜基質(zhì)的乳品容易產(chǎn)生假陽性。張鑫等[32]開展研究，將93份牛乳、馬乳、山羊乳、駱駝乳及不同比例摻比樣品進行脂肪酸指紋分析，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析構(gòu)建判別模型，模型判別準確性可以達到90%。但是模型判別對于建模樣品要求很高，不便于檢測方法推廣。Katharina等[33]采用雙向電泳結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)駱駝乳缺乏β-乳球蛋白，并且可通過蛋白質(zhì)指紋圖譜比對，實現(xiàn)對牛、山羊、水牛、馬和駱駝乳的區(qū)分。但是雙向電泳法操作繁雜，需要操作者有一定的實驗經(jīng)驗，并且耗時較長，檢測通量低，不適于大量檢測樣品的開展。Ke X等[34]建立UHPLC-MS/MS法，可對羊乳嬰幼兒配方乳粉中的4種牛乳酪蛋白和2種牛乳乳清蛋白進行檢測，檢測定量限可達0.01～0.05 g/100 g，可對復(fù)雜基質(zhì)進行檢測。但是，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備，設(shè)備成本高、對環(huán)境要求高，對實驗人員素質(zhì)要求也較高，不易實現(xiàn)大規(guī)模推廣。毛細管電泳技術(shù)檢測結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好、重復(fù)性高，檢測快捷高效，可以實現(xiàn)對靶標蛋白的快速篩查。

本研究采用毛細管電泳技術(shù)，通過對各乳品蛋白與10 ku內(nèi)標蛋白相對遷移時間，以及W1和W2蛋白峰峰面積比值進行聚類分析，篩選出差異較大的多個靶標蛋白峰，以及判定標準，實現(xiàn)對常見乳源成分進行檢測。初步建立了可實現(xiàn)馬科的驢乳和馬乳、駱駝乳、羊乳、和牛族動物（牛、水牛、牦牛）乳的區(qū)別。經(jīng)過電泳分析，我們可以發(fā)現(xiàn)，驢乳和馬乳出峰時間、峰面積比值基本相同，所以我們選取驢乳為研究對象，分析馬乳和驢乳與牛乳蛋白差異，蛋白W3穩(wěn)定存在馬乳和驢乳中，可作為馬乳和驢乳靶標蛋白；此外，結(jié)合本次試驗以及前期研究，牛族動物（牛、水牛、牦牛）乳特征蛋白C1和C4相對遷移時間可作為判定牛乳蛋白的靶標蛋白。本研究未找到駱駝乳特征蛋白，但是駱駝乳中β-乳球蛋白含量較低，其常見摻假乳品—牛乳的β-乳球蛋白含量較高，并且摻假現(xiàn)象主要是經(jīng)濟利益驅(qū)動，摻假比例過低無法獲得經(jīng)濟效益，所以，選定10%為檢測限，W1與W2的峰面積比值不低于3.5，并且存在C4蛋白則說明駱駝乳中摻雜牛乳。

但是，隨著人民生活水平的提高與乳品營養(yǎng)學(xué)研究的深入，牦牛乳、水牛乳等乳品也以其致敏性較低、營養(yǎng)豐富[35-36]等特點，越來越受到人們青睞，但是本研究建立的方法還無法對牛、水牛、牦牛乳進行很好的區(qū)分，后面的研究中，我們將通過嘗試毛細管區(qū)帶電泳、毛細管膠束電泳等電泳模式，對其進行區(qū)分研究。同時，現(xiàn)在所構(gòu)建的聚類模型由于數(shù)據(jù)量有限，無法進行樣品識別，后期我們將擴充樣本量，研究構(gòu)建判別模型。

4 結(jié)論

本研究采用毛細管凝膠電泳技術(shù)，計算各乳品蛋白峰與內(nèi)標蛋白相對遷移時間，構(gòu)建聚類分析模型，篩選特色乳品及牛乳的多個靶標蛋白峰以及判定標準，實現(xiàn)對常見乳源成分進行的檢測，方法精密度和重現(xiàn)性良好。在對市售特色乳品樣品檢測過程中，發(fā)現(xiàn)高比例的摻假產(chǎn)品。