山楂葉總黃酮提取工藝與藥理作用研究進(jìn)展

張德馨，王淑華，孫 仟，林 林，張 雪，林永強(qiáng)＊

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2. 國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022；3. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 國家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

山楂是藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材，能消食健胃、活血化淤、收斂止痢，對肉積痰飲、小兒乳食停滯等均有療效。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)山楂葉也有很高的藥用價(jià)值，黃酮類物質(zhì)如牡荊素，6, 8-二葡萄糖芹菜素，黃酮苷，牡荊素葡萄糖苷，槲皮素，金絲桃苷（HP），山柰酚，木犀草苷，牡荊素鼠李糖苷（VOR）等是其提取物中的主要活性成分[1]，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)和糖代謝、護(hù)肝、抗氧化、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈等多種藥理活性。

目前，山楂葉總黃酮（HLF）的提取方法不斷創(chuàng)新，對其藥效機(jī)制的研究也有了新的突破。本文對近年HLF的提取工藝與藥理活性的研究成果加以歸納，以期為山楂資源的開發(fā)與合理利用提供參考。

1 HLF的提取工藝

1.1 浸提法

姜紅紅等[2]采用70 %乙醇，料液比1:10（g/ml），70 ℃條件下保持微沸提取2.5 h，用LX158型號樹脂，3 BV水洗除雜后，用10 %乙醇洗脫除雜，6 BV的30 %乙醇洗脫的方案，依據(jù)藥典方法進(jìn)行分離條件優(yōu)化，解決了現(xiàn)有山楂葉提取物的制備方法成本高、總黃酮含量低的技術(shù)問題。

1.2 回流提取法

施紅林等[3]發(fā)現(xiàn)在液固比29 ml/g，乙醇體積分?jǐn)?shù)68 %，水浴溫度64 ℃，提取時(shí)間34 min的條件下HLF的平均粗提取率只有3.07 %。宋小峰等[4]采用醇提法，較施紅林等[3]延長了提取時(shí)間與溫度，使總黃酮提取率達(dá)到92.2 %，優(yōu)選出最佳的提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)65 %，提取時(shí)間80 min，提取溫度（67±1）℃。

1.3 超聲波輔助提取法

趙永福等[5]采用超聲波輔助提取法，在乙醇濃度50 %，料液比1:24（g/ml），pH 7，提取溫度 60 ℃，提取時(shí)間0.5 h 條件下HLF得率為2.43 %。弓威等[6]比較乙醇回流，超聲波輔助提取，普通浸提法等提取工藝的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助提取法明顯優(yōu)于其他方法。最終采取乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %、料液比1:35、超聲功率480 W、提取時(shí)間39 min、提取溫度72 ℃的方案，顯著縮短了時(shí)間，HLF平均得率為28.991 mg/g。磨正遵等[7]優(yōu)化超聲波輔助提取條件為超聲波功率140 W、料液比1:56、提取時(shí)間120 min、溫度59 ℃。該方法克服了傳統(tǒng)有機(jī)溶劑易污染黃酮成分的缺點(diǎn)。

1.4 超高壓萃取法

奚玉石等[8]首次把超高壓技術(shù)應(yīng)用到HLF的提取上，將山楂葉粉碎干燥，與45倍量50 %乙醇在無菌條件下混合塑封，300 MPa壓力下處理10 s，提取1次。結(jié)果表明超高壓技術(shù)不僅能在較短時(shí)間內(nèi)獲得較高的提取率，且提取液的顏色澄清，雜質(zhì)少。周志強(qiáng)等[9]提出給壓超過400 MPa時(shí)提取率變化不大，與奚玉石[8]提出的由于細(xì)胞內(nèi)溶出的大分子物質(zhì)阻塞傳質(zhì)通道，給壓過高不利于黃酮類化合物的擴(kuò)散的觀點(diǎn)一致。

1.5 微波提取

微波場中釋放的能量被樣品吸收后，產(chǎn)生的熱效應(yīng)擴(kuò)可破環(huán)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使成分加速溶出。施昶[10]通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化微波提取HLF的條件，最終確定在體積分?jǐn)?shù)56 %乙醇中浸提15 min，液固比為51 ml/g，微波輻射時(shí)間3.70 min的提取條件。

2 藥理作用

2.1 對心血管的影響

2.1.1 治療慢性心衰 賀粵等[11]采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支引起的慢性心衰小鼠模型，發(fā)現(xiàn)200 mg/(kg·d)的HLF能提高小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)，對血管緊張素II（Ang II）、血漿醛固酮的表達(dá)有較好的減弱作用，從而抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RRAS）系統(tǒng)，與卡托普利在心衰方面治療作用相當(dāng)。Holubarsch等[12]對山楂葉醇提物低聚原花青素類成分WS 1442的現(xiàn)有臨床前和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該中草藥產(chǎn)品對心力衰竭的浮腫、呼吸困難、疲勞等癥狀療效顯著，可改善輕度至中度心力衰竭患者的心功能和運(yùn)動(dòng)耐量，并具有正性肌力作用，且不會引起再灌注心律失常、食欲不振、便秘、肝纖維化等特定的不良反應(yīng)。

徐穎等[13]采用Ang II致心肌細(xì)胞肥大的慢性心衰模型，發(fā)現(xiàn)配合使用200 μg/ml HLF能干預(yù)慢性心衰模型中線粒體的功能，減輕心肌細(xì)胞中線粒體的內(nèi)、外膜損傷率，顯著降低心肌細(xì)胞直徑，并能下調(diào)Ang II所致異常升高的蛋白質(zhì)含量，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

2.1.2 保護(hù)缺血心肌細(xì)胞 心肌酶的濃度可以作為檢測心肌缺血程度的指標(biāo)。孫建峰等[14]采用麻醉后結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈前左降支方法建立急性心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)使用高、中劑量HLF注射液的動(dòng)物ST段升高總值及梗死范圍占全心質(zhì)量百分比、心室質(zhì)量百分比明顯低于對照組，在血清中檢測到的肌酸磷酸激酶（CPK）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）等濃度較低，超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，表明HLF可保護(hù)缺血心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，抑制心肌酶的釋放，減少心肌梗死面積。推測其作用機(jī)制與減少心肌細(xì)胞耗氧量，增加冠脈流量，降低細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。

邱曉梅等[15]研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射HLF對缺血心肌細(xì)胞灌注前后的心功能有明顯影響，心肌酶濃度、丙二醛（MDA）濃度降低，SOD水平升高，表明HLF能抑制氧自由基（ROS）引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，這一結(jié)果與Koch等[16]總結(jié)山楂葉黃酮對心肌再灌注損傷細(xì)胞的作用機(jī)制結(jié)論一致，即山楂葉黃酮可削弱缺血極早期細(xì)胞氧化磷酸化水平降低造成的去極化作用，阻滯鈣內(nèi)流，減輕細(xì)胞鈣超載，增強(qiáng)抗氧化能力，減少室性心律失常的發(fā)生率，對缺血的心肌細(xì)胞起直接保護(hù)作用。

2.2 抗腦缺血作用

李蒙蒙等[17]對大鼠側(cè)頸總動(dòng)脈永久性雙重結(jié)扎，建立慢性腦缺血模型。結(jié)果顯示用HLF灌胃的大鼠神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完好，密度增加，腦組織病變減輕。表明HLF可減弱因神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過度活化分泌的抑制因子、受體及炎癥遞質(zhì)的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)神經(jīng)元與軸突的再生能力。還能通過減弱p38分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）表達(dá)水平，阻止腦細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)腦細(xì)胞生長，對血管性癡呆小鼠的記憶力有良好的改善作用[18]。

曲若寧等[19]觀察發(fā)現(xiàn)HLF對腦缺血再灌注模型大鼠損傷的海馬CA1區(qū)有顯著改善，并與治療腦缺血成一定的量效關(guān)系，能維持神經(jīng)元細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，減少腦組織死亡區(qū)域，其機(jī)制與抑制胱天蛋白酶3（caspase-3）蛋白酶的陽性表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡效應(yīng)有關(guān)。陳進(jìn)玲等[20]發(fā)現(xiàn)HLF聯(lián)合丁苯酞能調(diào)節(jié)老年腦梗死患者總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等血脂水平，能更好地改善大腦動(dòng)脈血管狹窄，使神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分降低。HLF還能改善缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，保護(hù)作用可能與增強(qiáng)miR-133b表達(dá)，進(jìn)而降低X-連鎖的RNA結(jié)合基序蛋白（RBMX）的表達(dá)能力有關(guān)[21]。

2.3 抗動(dòng)脈粥樣硬化

高英英等[22]認(rèn)為HLF可穩(wěn)定動(dòng)脈組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）的蛋白水平，使纖維帽膠原消融、生長環(huán)境達(dá)到平衡，維持血管結(jié)構(gòu)。另外，使用HLF注射液后小鼠血管壁中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）mRNA增加，推測HLF含PPARγ配體類物質(zhì)，能抑制細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）的基因表達(dá)，阻止單核細(xì)胞動(dòng)脈硬化斑塊遷移，減輕大鼠動(dòng)脈粥樣硬化血管的內(nèi)皮損傷程度[23]。于悅卿等[24]研究表明HLF能降低ApoE基因敲除小鼠的TC、TG、LDL-C含量，增強(qiáng)抗炎因子白介素8（IL-8）水平，降低MDA含量，增加SOD含量，調(diào)節(jié)動(dòng)脈硬化導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。

2.4 保護(hù)肝功能

2.4.1 減輕酒精性肝損傷 HLF被證實(shí)能通過減少肝細(xì)胞凋亡[25]，并清除自由基，提高抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來減輕酒精性肝損傷[26]。

2.4.2 減輕非酒精性肝損傷 環(huán)氧合酶-2（COX-2）是引發(fā)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)之一，參與肝臟充血、水腫等癥狀的發(fā)生與發(fā)展。在HLF干預(yù)下，高脂導(dǎo)致的肝損傷小鼠體內(nèi)血紅素氧合酶1（HO-1）的表達(dá)增強(qiáng)，COX-2的表達(dá)降低，鼠抗8-羥基脫氧鳥苷酸的表達(dá)減弱，證明HLF可減輕DNA氧化導(dǎo)致的細(xì)胞損傷和肝組織炎癥，顯著提高肝組織總抗氧化能力[27]。

核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）在保持氧化和抗氧化之間的平衡及減少氧化應(yīng)激引起的損傷中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)HLF通過增加Nrf2、HO-1，谷氨酸半胱氨酸連接酶、NAD（P）H醌氧化還原酶1的表達(dá)，在抗氧化中起重要作用[28]。反映出HLF可緩解肝臟氧化應(yīng)激，維持肝細(xì)胞功能，祛除炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)肝臟的抗氧化能力。

降低P4502E1 mRNA和蛋白表達(dá)是治療非酒精性肝病的靶點(diǎn)。陳芝蕓等[29]發(fā)現(xiàn)隨著給小鼠灌服的HLF濃度升高，對細(xì)胞色素P4502E1的抑制活性增加。一方面能使谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、SOD分解過氧化物的活性增強(qiáng)，減少自由基的生成；另一方面可避免脂質(zhì)積累產(chǎn)生的活性氧誘導(dǎo)下游促炎癥因子的表達(dá)。

2.5 降壓調(diào)脂質(zhì)作用

張振等[30]研究發(fā)現(xiàn)，HLF可降低高脂高鹽小鼠血清中CPK、LDH、AST的活性，并提高抗氧化酶如SOD、GSH-Px的活性，保護(hù)缺血心肌細(xì)胞，還能降低Ang II水平、血脂含量和心臟做功系數(shù)，抑制血管的過度收縮，降低血壓并維持舒張壓和收縮壓的穩(wěn)定。

刁婷婷等[31]以高脂血癥大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)經(jīng)HLF灌胃處理的大鼠肝臟組織中的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）表達(dá)增加，乙酰輔酶A羧化酶（ACC）磷酸化減弱，脂肪酸的合成速度減緩，脂肪變性與浸潤程度減輕，脂質(zhì)代謝增強(qiáng)，肝臟脂質(zhì)沉積狀況呈劑量依賴性改善。推測其機(jī)制與調(diào)節(jié)AMPK/ACC通路的蛋白表達(dá)水平有關(guān)。HLF還能激活法尼酯衍生物受體，下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）表達(dá)，對甘油三酯的積累有一定的消除作用[32]。

另外，HLF還能有效緩解組織培養(yǎng)肝細(xì)胞受抑制狀態(tài)，減輕脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞腫脹等藥理損傷，能降低羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）、上調(diào)低密度脂蛋白受體（LDLR）的陽性表達(dá)。HLF不但減少膽固醇的合成，還能清除肝臟中游離的膽固醇[33]。

2.6 治療糖尿病并發(fā)癥與抗氧化作用

2.6.1 治療糖尿病并發(fā)癥 齊淑芳等[34]采用注射鏈脲佐菌（STZ）配合高脂高糖喂養(yǎng)誘發(fā)2型糖尿病大鼠為研究模型，發(fā)現(xiàn)HLF能增強(qiáng)骨形成蛋白-7表達(dá)，減弱腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)，從而改善糖代謝異常為主因所致的腎小球硬化，使腎臟細(xì)胞纖維化概率降低，并明顯減輕大鼠腎細(xì)胞受損程度及尿蛋白、肌酐、血糖及血尿素氮含量，維持腎臟正常生理功能。趙曉蓮等[35]還發(fā)現(xiàn)HLF對腎小球系膜細(xì)胞增生、胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，腎小管擴(kuò)張腫脹等病理性改變同樣有治療作用，有明顯降糖效果，對糖尿病腎小球硬化癥早期的微血管病變有良好療效，推測機(jī)制與降低腎局部胰島素樣生長因子1（IGF-1）及胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP-3）過表達(dá)有關(guān)。

HLF除了能維持腎臟生理功能外，另有研究表明HLF對STZ誘發(fā)2型糖尿病小鼠的胰腺組織[36]、睪丸[37]、腦組織[38]都有顯著的保護(hù)作用。不僅能保護(hù)各組織的細(xì)胞形態(tài)并降低其凋亡系數(shù)，還能增強(qiáng)組織中抗氧化酶的活性，改善胰腺、睪丸、腦組織中超微結(jié)構(gòu)病變，維持血糖和胰島素分泌的穩(wěn)定性。

韓偉[39]發(fā)現(xiàn)高、中劑量VOR、HP可下調(diào)AMPK、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）mRNA表達(dá)水平，并明顯降低高糖高脂培養(yǎng)胰島素抵抗（IR）HePG2細(xì)胞內(nèi)的TC、TG積累，維持細(xì)胞的糖脂代謝平衡，其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK通路有關(guān)。

2.6.2 抗氧化作用 龔霞等[40]萃取山楂葉有機(jī)提取物中不同部位的極性組分，比較其對DPPH自由基、超氧自由基及Fe2+螯合能力的影響。結(jié)果表明正丁醇相的總還原能力最強(qiáng)，石油醚相的抗氧化能力遠(yuǎn)低于其他組分。

李艷榮等[41]發(fā)現(xiàn)山楂葉 50 %乙醇提取物、50 %乙醇的乙酸乙酯部位、50 %乙醇的水飽和正丁醇部位、2015年版《中國藥典》收錄的HLF均具有一定的體外抗氧化能力。且總黃酮含量越高，抗氧化能力越強(qiáng)。

2.7 其他藥理作用

實(shí)驗(yàn)表明HLF能有效降低惡性膠質(zhì)瘤 U87 細(xì)胞的黏附能力，可引起瘤細(xì)胞外形皺縮、破損，對瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力有明顯抑制作用，作用強(qiáng)度與濃度呈正相關(guān)[42]。Zhang等[43]發(fā)現(xiàn)，使用HLF治療后，脊髓損傷大鼠脊髓組織的病變腔和凋亡細(xì)胞數(shù)減少，神經(jīng)元水腫減輕、內(nèi)尼氏小體增多。即HLF能保護(hù)受損的大鼠脊髓神經(jīng)，在脊髓損傷后促進(jìn)軀干恢復(fù)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性中具有治療潛力。

3 討論

在提取工藝方面，黃酮類化合物作為山楂葉的藥效指標(biāo)成分，單純?nèi)軇┨崛‰m然操作簡單、HLF得率高，但耗時(shí)長。超聲波的熱效應(yīng)與機(jī)械振動(dòng)的助溶作用，會加速細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，能縮短時(shí)間、提高效率。超高壓提取法短時(shí)間內(nèi)極高的壓力差變化則促進(jìn)了提取溶劑的滲透及有效成分的溶出，與加熱回流法相比，溶劑的揮發(fā)減少，升壓、保壓、卸壓、加料等單元借助機(jī)械完成，也無較大的能量消耗。微波技術(shù)可使用更少的溶劑量，使整個(gè)物料內(nèi)部加熱，克服了傳統(tǒng)加熱方法由外向內(nèi)，升熱較慢的缺點(diǎn)，而微波提取技術(shù)與傳統(tǒng)溶劑提取法相結(jié)合的方法溫和安全。市面上流通的HLF注射液的制備多為企業(yè)專利，可查閱到的粗提方法有取山楂葉在40 %乙醇、50 ℃下浸提后再加工[44]。而超聲波輔助提取、超高壓提取與微波提取可同時(shí)處理較大的批量，選擇性高，能節(jié)約時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

目前，HLF在解決高致病率、高死亡率的心血管問題，參與2型糖尿病并發(fā)癥與肝腎系統(tǒng)損傷的治療中均有良好表現(xiàn)，其抗氧化、抗炎、降脂、調(diào)節(jié)酶活性等作用成為研究熱點(diǎn)。山楂樹葉資源有廣闊的開發(fā)前景。