天然寄主替代茶葉增殖EgNPV的方法

譚榮榮，毛迎新，黃丹娟，王友平

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a果樹茶葉研究所 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心果茶分中心，b植保土肥研究所，湖北 武漢 430064)

灰茶尺蠖(EctropisgrisescensWarren)屬鱗翅目尺蛾科害蟲，中國各茶區(qū)均有發(fā)生，尤以鄂、湘、皖等地及江浙一帶最為嚴(yán)重。以幼蟲食葉為害，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)，茶樹葉片及嫩芽被啃食殆盡，狀如火燒，嚴(yán)重影響茶葉產(chǎn)量，且易導(dǎo)致茶樹早衰、耐寒力差[1]?；也璩唧对诙鯑|、鄂南等局部地區(qū)頻繁暴發(fā)成災(zāi)，年發(fā)生5～6代，除第1代發(fā)生整齊外，其余各世代重疊，防治難度較大?；也璩唧逗诵投嘟求w病毒EctropiegrisescensNucleopolyhedrovirus (EgNPV)是灰茶尺蠖重要的病原微生物，對灰茶尺蠖幼蟲具有較強(qiáng)的侵染力和毒力，對灰茶尺蠖田間種群具有良好的控制作用，對人、畜及天敵昆蟲安全[2-3]，尤其可通過水平擴(kuò)散和垂直傳播途徑形成病毒流行鏈，實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)害蟲持續(xù)控制[4]?；也璩唧逗诵投嘟求w病毒專擇性極強(qiáng)，只能在寄主活體內(nèi)或細(xì)胞中增殖，生產(chǎn)條件要求相對嚴(yán)格，因此能否解決病毒生產(chǎn)問題成為該病毒在生產(chǎn)實(shí)際中能否發(fā)揮作用的關(guān)鍵。目前，生產(chǎn)灰茶尺蠖病毒主要采用室內(nèi)宿主活體增殖的方式，即通過接毒感染宿主幼蟲生產(chǎn)病毒。但由于使用傳統(tǒng)方法，即用茶樹新梢養(yǎng)蟲生產(chǎn)病毒效率低、成本高，不適宜作為飼料大規(guī)模養(yǎng)蟲增殖病毒。為此，本研究從篩選新的天然替代飼料入手，以期有效解決灰茶尺蠖病毒大量擴(kuò)繁的難題。

1 材料與方法

1.1 材料

灰茶尺蠖蛹采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所試驗(yàn)基地，天然替代飼料由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所提供。該天然替代飼料接骨草(Sambucuschinensis)為多年生草本植物，喜溫濕氣候，分布廣泛，在我國浙江、安徽、江西、湖南、湖北、福建、廣東、廣西、四川等省區(qū)野生或栽培，其人工栽培可種子繁殖或分株繁殖。

1.2 灰茶尺蠖飼養(yǎng)方法

將健康灰茶尺蠖蛹置于消毒后的養(yǎng)蟲容器內(nèi)，室溫下待蟲蛹羽化后，在養(yǎng)蟲容器內(nèi)放入10%蔗糖溶液供成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)，并以高密紗布覆蓋養(yǎng)蟲容器，供交配后雌蟲在其表面產(chǎn)卵。始見初孵幼蟲后，開始用細(xì)口瓶水培接骨草或茶枝，置于養(yǎng)蟲容器周圍，供孵出的幼蟲取食。每個(gè)容器承裝4瓶接骨草或茶枝，飼養(yǎng)齡期一致的幼蟲300～500頭，養(yǎng)蟲容器覆蓋雙層高密紗布，防止幼蟲逃逸。在整個(gè)幼蟲飼養(yǎng)過程中，根據(jù)飼料新鮮程度和被取食程度，更換和添加飼料，飼養(yǎng)直至幼蟲化蛹。

1.3 天然替代飼料增殖病毒方法

待灰茶尺蠖成蟲產(chǎn)卵幼蟲孵化后，先用替代原料喂養(yǎng)灰茶尺蠖幼蟲，當(dāng)灰茶尺蠖幼蟲長至3齡，開始接種病毒(接毒濃度為5×106PIB·mL-1)。接種病毒5 d后開始逐日收集染毒死蟲。收集的蟲尸加50%甘油，置-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 灰茶尺蠖核型多角體病毒提純

將感染病毒死亡的灰茶尺蠖蟲尸加PBS緩沖液充分研磨后，4層紗布過濾，將濾液置于4 ℃條件下離心，500 r·min-1離心5 min棄沉淀，上清液再用3 500 r·min-1離心30 min，然后用適量緩沖液重新懸浮沉淀，3 500 r·min-1離心30 min。差速離心反復(fù)進(jìn)行多次，直至多角體懸液呈乳白色狀。病毒用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，使用等體積PBS緩沖液稀釋，于4 ℃冰箱保存待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼料飼養(yǎng)對灰茶尺蠖生長的影響

采用接骨草飼養(yǎng)灰茶尺蠖一個(gè)世代，以茶葉喂養(yǎng)為對照。表1表明，以接骨草飼養(yǎng)的灰茶尺蠖幼蟲發(fā)育歷期14.5 d，較對照延長1～2 d，幼蟲存活率85.7%，蛹重89.78 mg，蛹發(fā)育歷期8.25 d，羽化率84.3%，每雌平均產(chǎn)卵量138.6粒，卵孵化率86.4%，其各項(xiàng)指標(biāo)與對照無顯著差異。通過試驗(yàn)觀察還發(fā)現(xiàn)，水培接骨草存放時(shí)間較久，出現(xiàn)萎蔫一般在5 d以上，飼養(yǎng)方便。同時(shí)獲取接骨草枝條比茶枝省力，節(jié)省人工。且接骨草種植比較方便，成本更低。

表1 接骨草與茶葉飼養(yǎng)灰茶尺蠖的發(fā)育指標(biāo)對比

2.2 接骨草飼養(yǎng)灰茶尺蠖的接毒時(shí)期和死亡率

將接骨草養(yǎng)蟲增殖的病毒提純，分別稀釋成2.5×106、5.0×106、7.5×106、1.0×107PIB·mL-14個(gè)濃度，分別接種1、2、3、4、5齡幼蟲，飼養(yǎng)至幼蟲化蛹，計(jì)算不同濃度病毒感染不同齡期幼蟲的死亡率。

表2表明，灰茶尺蠖幼蟲3齡前對病毒相對敏感，4～5齡敏感性降低。就感病死蟲齡期而言，1齡接毒，3齡前死亡蟲數(shù)占死亡總數(shù)的80%以上；2齡接毒，4齡前死亡蟲數(shù)占死亡總數(shù)的40%；3齡接毒，末齡幼蟲染毒死亡數(shù)占死亡總數(shù)的85%以上。從幼蟲發(fā)病率、收獲病毒量綜合考慮，應(yīng)用接骨草飼養(yǎng)灰茶尺蠖增殖病毒的適宜時(shí)期和濃度為3齡幼蟲5.0×106PIB·mL-1。

表2 灰茶尺蠖病毒感染不同齡期幼蟲的試驗(yàn)結(jié)果

注：對照死亡率3.1%。

2.3 接骨草飼養(yǎng)不同世代灰茶尺蠖幼蟲增殖病毒效果

在室內(nèi)自然條件下，以濃度為5.0×106PIB·mL-1病毒液接毒感染各世代灰茶尺蠖3齡幼蟲，接毒5 d后逐日收集死蟲，記載感病死亡蟲數(shù)，至幼蟲化蛹，計(jì)算各代幼蟲的感病死亡率，并將各代增殖的病毒蟲尸分別稱重后進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在灰茶尺蠖不同世代都可以進(jìn)行病毒增殖，其中以第1、2、3和6代為宜(表3)。

表3 不同世代灰茶尺蠖增殖病毒效果比較

2.4 接骨草與茶葉增殖灰茶尺蠖核型多角體病毒效率比較

在灰茶尺蠖第1～5代發(fā)生期，以接骨草飼養(yǎng)灰茶尺蠖幼蟲增殖病毒，茶葉喂養(yǎng)為對照，各代均飼養(yǎng)至幼蟲化蛹，將2種飼料養(yǎng)蟲生產(chǎn)的灰茶尺蠖病毒蟲尸分別稱重，折算成每頭蟲尸重后，進(jìn)行比較。表4表明，接骨草養(yǎng)病蟲尸重略高于茶葉所養(yǎng)病蟲尸重，按照感病宿主蟲尸生物量與病毒產(chǎn)量正相關(guān)原則，接骨草養(yǎng)蟲產(chǎn)毒量高于茶葉養(yǎng)蟲的產(chǎn)毒量。

2.5 接骨草與茶葉增殖灰茶尺蠖核型多角體病毒毒力比較

表4 接骨草與茶葉飼養(yǎng)灰茶尺蠖增殖其核型多角體病毒的效率比較

提純接骨草、茶葉養(yǎng)蟲增殖的典型病毒，分別稀釋成1×105、5×105、1×106、5×106PIB·mL-14個(gè)濃度，室內(nèi)接毒感染灰茶尺蠖3齡幼蟲，接毒5 d后逐日收集感病蟲尸，飼養(yǎng)直至幼蟲化蛹，記載感病死亡蟲數(shù)，計(jì)算感病死亡率和校正死亡率，并求算毒力回歸方程及LC50。表5表明，接骨草養(yǎng)蟲增殖的病毒毒力略高于茶葉養(yǎng)蟲增殖的病毒。

表5 接骨草與茶葉飼養(yǎng)灰茶尺蠖增殖其核型多角體病毒的毒力比較

注：對照死亡率為3.6%。毒力回歸方程接骨草為y=-4.152 3+1.53x，LC50=5.25×105PIB·mL-1；茶葉為y=-0.765 82+1.016 75x，LC50=5.98×105PIB·mL-1。

3 小結(jié)與討論

通常野外接毒和室內(nèi)接毒都可以實(shí)現(xiàn)病毒的增殖，但前者更易受到環(huán)境因素制約，如溫度、濕度、光照、雨水、肉食性昆蟲等，都會對病毒的產(chǎn)量造成影響，甚至導(dǎo)致病毒殺蟲活性降低[5-6]；相比之下，室內(nèi)接毒方式可控性強(qiáng)，病毒生產(chǎn)量穩(wěn)定，是當(dāng)前昆蟲病毒活體增殖的最主要途徑。目前，我國在灰茶尺蠖飼養(yǎng)方面的研究較少，而在其近似種茶尺蠖飼養(yǎng)研究方面已初見成效，可用于灰茶尺蠖室內(nèi)飼養(yǎng)參考。2007年，陳建明等[7]公開了“一種茶尺蠖的人工飼料，其制備及茶尺蠖的飼養(yǎng)方法”；2005年，張永安等[8]公開了“一種茶尺蠖人工飼養(yǎng)和傳代方法”。這2種方法均明確提出茶尺蠖人工飼料配方及應(yīng)用該飼料全年、繼代飼養(yǎng)方法，但文中并未涉及人工飼料養(yǎng)蟲產(chǎn)毒效率及病毒毒力等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)。劉琴等[9]采用人工飼料飼養(yǎng)茶尺蠖發(fā)現(xiàn)，幼蟲歷期和世代歷期分別為20和39.62 d，較茶樹嫩梢飼養(yǎng)歷期分別增加1.44和2.41 d。1992年葉恭銀等[10]研究發(fā)現(xiàn)，以菊花葉片為飼料，茶尺蠖幼蟲取食量、蛹期、蛹重、產(chǎn)卵量、種群特征參數(shù)與以茶樹葉片為飼料的相比無顯著性差異，僅幼蟲歷期延長1～2 d，以其飼養(yǎng)茶尺蠖增殖病毒量也未受顯著影響，但文中未對2種飼料增殖病毒的毒力進(jìn)行比較，且菊花需要盆栽，操作麻煩，推廣應(yīng)用上較為困難。

本研究使用的接骨草[11]具有2個(gè)優(yōu)點(diǎn)。1)適用性強(qiáng)。接骨草為灰茶尺蠖野生寄主植物，幼蟲喜食，生長發(fā)育正常。在武漢地區(qū)，以接骨草為飼料飼養(yǎng)灰茶尺蠖(第4代)，幼蟲發(fā)育歷期14.5 d，存活率85.7%，蛹?xì)v期8.25 d，羽化率84.3%，每雌平均產(chǎn)卵量138.6粒，其各項(xiàng)生物學(xué)特征參數(shù)與茶葉飼養(yǎng)的參數(shù)值無顯著性差異；其次接骨草來源廣泛，通常在茶園附近、林間、溝邊生長，容易獲得，成本低廉。2)生產(chǎn)病毒效率高。應(yīng)用接骨草飼養(yǎng)灰茶尺蠖增殖其核型多角體病毒，使得85%以上幼蟲至末齡幼蟲期染毒死亡，降低幼蟲提早死亡或化蛹的比例。按照感病宿主蟲尸生物量與病毒產(chǎn)量正相關(guān)原則，以接骨草為飼料增殖病毒量(平均每頭重量0.050 7 g)高于茶葉養(yǎng)蟲的產(chǎn)毒量(平均每頭重量0.049 0 g)。由此看來，采用接骨草飼養(yǎng)灰茶尺蠖能夠克服傳統(tǒng)飼料無法全年、繼代飼養(yǎng)的難題。應(yīng)用接骨草增殖灰茶尺蠖核型多角體病毒，提高了病毒生產(chǎn)效率和毒力，降低了生產(chǎn)成本，有效解決了病毒大量擴(kuò)繁的難題，且操作簡單，容易被茶農(nóng)接受，推廣應(yīng)用前景廣闊。

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