仿生電活性涂層鈦植入材料促進骨結(jié)合的實驗研究

白云洋 孫曉雯 王逸君 張學(xué)慧

醫(yī)用金屬鈦(Ti)及其合金由于其良好的可加工性以及優(yōu)異的生物相容性而被廣泛用于口腔和骨科臨床[1-2]。然而，鈦種植體表面由于生物活性差，導(dǎo)致骨結(jié)合效果不理想。國內(nèi)外學(xué)者嘗試了許多物理及化學(xué)方法來提高的金屬鈦及其合金表面活性，包括表面改性和活化涂層。表面改性是通過噴砂、酸蝕、微弧氧化以及等離子噴涂等方法來提高鈦植入體表面的的生物活性[3-4]。但這類改性的表面尚未提供良好的生物活性，骨結(jié)合效果仍然不能滿足臨床需求。理想的植入體表面應(yīng)為新骨形成提供一個良好的骨誘導(dǎo)微環(huán)境，提高新骨生成和骨結(jié)合效果，同時應(yīng)具備良好的骨結(jié)合穩(wěn)定性。近年來，電活性材料受到研究者的廣泛關(guān)注，因為這類材料可以通過設(shè)計加工實現(xiàn)仿生電活性，為細胞功能分化和新骨生成提供適宜的電學(xué)微環(huán)境[5-6]。聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)及其共聚物如聚偏氟乙烯三氟乙烯[polyvinylidene fluoride trifluoroethylene,P(VDF-TrFE)]具有良好的壓電性、力學(xué)性能及生物相容性，適合用于鈦表面改性的電活性膜[7-8]。為了進一步增強PVDF壓電聚合物的力學(xué)性能，并便于設(shè)計調(diào)節(jié)實現(xiàn)仿生電活性，本課題組前期通過摻雜并調(diào)節(jié)鈦酸鋇(BaTiO3，BTO)納米顆粒含量，實現(xiàn)了仿生電活性BaTiO3/P(VDF-TrFE)納米復(fù)合膜材料的穩(wěn)定可控制備，并通過體外細胞實驗、體內(nèi)動物實驗證實了該材料促進骨再生與修復(fù)的有效性[9-10]。本研究將前期優(yōu)化后的仿生電活性BaTiO3/P(VDF-TrFE)納米復(fù)合材料技術(shù)用于鈦植入材料的表面涂層改性，擬通過比較仿生電活性涂層和左旋聚乳酸(Poly L-lactic acid,PLLA)涂層對促進兔骨結(jié)合的作用差異，旨在驗證和穩(wěn)定仿生電活性BaTiO3/P(VDF-TrFE)納米復(fù)合材料作為種植體涂層材料的可行性和有效性。

資料與方法

一、資料

1.主要材料、設(shè)備和實驗動物：聚偏氟乙烯-三氟乙烯P(VDF-TrFE)(70/30，PIEZOTECH，法國)、鈦酸鋇納米顆粒(BTO，粒徑100 nm，阿拉丁，上海)；左旋聚乳酸(PLLA，分子量7 000，山東省醫(yī)療器械研究所)；N，N-二甲基甲酰胺(國藥集團化學(xué)試劑公司，北京)、三氟乙醇(國藥集團化學(xué)試劑公司，北京)；純鈦棒(直徑為2 mm，長度為5 mm，自備)、鹽酸多巴胺(Alfa Aesar，美國)；電暈極化裝置(HYJH-20KV，陜西惠研新材料科技有限公司)；準(zhǔn)靜態(tài)D33測量儀(ZJ-3AN, 中科院聲學(xué)所，北京)；新西蘭大白兔(雄性，2.5～3 kg，購自北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SYXK[(京)2016-0007]；硬組織切磨系統(tǒng)(EXAKT，德國)；骨形態(tài)分析儀(BIOQUANT，美國)。

2.仿生電活性涂層鈦植入材料的設(shè)計和制備：根據(jù)文獻[9-10]方法，稱取一定量的經(jīng)多巴胺改性后的鈦酸鋇納米顆粒，分散于N，N二甲基甲酰胺溶液中。超聲/攪拌各30 min(交替3次)，之后加入P(VDF-TrFE)形成均勻穩(wěn)定的懸濁液。按照設(shè)定鈦酸鋇的含量配制含體積分數(shù)5%鈦酸鋇納米顆粒的混合液。對純鈦柱先用SiO2顆粒在0.4 mPa壓力條件下進行噴砂處理，然后用10% H2SO4與10% HCl混合液在60 ℃恒溫條件下酸蝕30 min。取50 μl上述BTO/P(VDF-TrFE)溶液均勻涂覆在噴砂-酸蝕處理后的鈦柱表面，在80 ℃下烘干2 h以蒸發(fā)溶劑并在鈦柱表面形成均勻涂層。相同方法制備PLLA涂層鈦柱材料作為對照組。將電活性涂層鈦柱置于電暈極化裝置樣品臺上，設(shè)置樣品與極化極頭間距離為15 mm，施加電壓15 kV；在常溫條件下極化30 min。

二、方法

1.表面形貌觀察：樣品經(jīng)噴金處理后，在掃描電子顯微鏡下觀察不同涂層植入材料的表面形貌，并利用X線微區(qū)分析方法(energy dispersive spectrometer，EDS)對元素組成進行分析。

2.表面粗糙度檢測：采用原子力顯微鏡檢測不同涂層植入材料的表面粗糙度，掃描選取范圍為10 μm×10 μm。

3.親疏水性檢測：將不同涂層植入材料樣品固定在載玻片上，然后置于載物臺上，調(diào)整蒸餾水液滴約2 μl，滴在樣品表面，利用量角法計量液滴接觸角大小。每組材料取5個平行樣，求平均值。

4.電學(xué)性能檢測：將BTO/P(VDF-TrFE)電活性涂層鈦植入材料置于d33準(zhǔn)靜態(tài)測量儀中進行壓電常數(shù)d33測試，并將樣品置于37 ℃無血清細胞培養(yǎng)基中孵育7 d后再行d33測試。每次測試取5個測試點，求平均值。

5.動物實驗：本實驗研究獲北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會審批。取新西蘭大白兔6只，脛骨皮膚剃毛、鋪巾、消毒。在雙側(cè)脛骨外側(cè)位置作皮膚切口直達骨面，剝離骨膜暴露脛骨。利用2 mm列鉆在每側(cè)的脛骨外側(cè)面制備3個直徑為2 mm的圓形單側(cè)骨壁穿透缺損，缺損間距為1 cm。在左側(cè)脛骨缺損處植入PLLA涂層對照鈦柱；右側(cè)脛骨缺損處植入仿生電活性涂層鈦柱(圖1)。術(shù)后縫合、消毒。術(shù)后4周和12周分別取材，樹脂包埋。采用硬組織切磨系統(tǒng)制備硬組織切片，亞甲藍染色。最后通過骨形態(tài)分析儀對植入體周圍的骨結(jié)合率(BIC)進行分析。

圖1 BTO/P(VDF-TrFE)涂層鈦植入材料植入兔脛骨缺損手術(shù)(黃色箭頭所示植入材料)

結(jié) 果

一、仿生電活性涂層鈦植入材料的表面形貌與結(jié)構(gòu)

掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，純鈦表面可見深淺不一的凹坑結(jié)構(gòu)(圖2A-B)，微坑直徑約為2～5 μm(圖2C)。EDS能譜分析證實材料的主要成分為鈦(圖2D)。PLLA涂層表面可見一層較為均勻而致密的聚合物膜附著于鈦表面(圖2E-G)。EDS能譜分析結(jié)果顯示材料表面的主要元素組成為Ti、C和O(圖2H)。仿生電活性BTO/P(VDF-TrFE)涂層鈦植入材料表面可見鈦酸鋇納米顆粒均勻分散在壓電聚合物P(VDF-TrFE)中(圖2I～K)，并經(jīng)EDS檢測證實其主要成分為Ti、Ba和F等(圖2L)。表面粗糙度檢測結(jié)果顯示，仿生電活性BTO/P(VDF-TrFE)涂層的表面粗糙度略高于PLLA涂層，仿生電活性BTO/P(VDF-TrFE)涂層表面粗糙度為(162.2±19.4)nm；PLLA涂層表面粗糙度為(145.2±18.4)nm，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。水接觸角測試結(jié)果顯示，仿生電活性BTO/P(VDF-TrFE)涂層表面的水接觸角為(92.0±2.5)°；PLLA涂層表面的水接觸角為(89.1±1.9)°，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 不同聚合物涂層鈦植入材料表面形貌掃描電鏡觀察和EDS成分表征結(jié)果 A～D 無涂層鈦表面及EDS檢測結(jié)果 E～H PLLA涂層鈦表面及EDS檢測結(jié)果 I～L BTO/P(VDF-TrFE)涂層鈦表面及EDS檢測結(jié)果；SEM圖片顯示標(biāo)尺分別為1、200 μm和10 μm

二、仿生電活性涂層鈦植入材料的電學(xué)性能

壓電常數(shù)測試結(jié)果顯示，BTO/P(VDF-TrFE)涂層的壓電常數(shù)d33為6.27 pC/N，接近天然骨組織的壓電常數(shù)量級。體外放置7 d后的壓電常數(shù)d33為6.03 pC/N，仍保持初始壓電常數(shù)的96%以上。仿生電活性BTO/P(VDF-TrFE)涂層具有良好的早期電學(xué)穩(wěn)定性，可能對其生物學(xué)性能起到積極作用。

三、仿生電活性涂層鈦植入材料的骨結(jié)合性能

術(shù)后4周，仿生電活性BTO/P(VDF-TrFE)涂層材料表面和新骨結(jié)合緊密，涂層材料穩(wěn)定無降解。PLLA涂層材料表面由于PLLA屬于可降解高分子，材料有部分降解導(dǎo)致新骨結(jié)合較差(圖3A-D)。骨結(jié)合率檢測顯示，仿生電活性BTO/P(VDF-TrFE)涂層的骨結(jié)合率明顯高于PLLA涂層(圖3E)。術(shù)后12周，兩組的新骨成熟程度均明顯增加，骨陷窩結(jié)構(gòu)明顯，仿生電活性BTO/P(VDF-TrFE)涂層仍然保持穩(wěn)定狀態(tài)，與成熟的新骨結(jié)合緊密。PLLA涂層進一步發(fā)生降解，和新骨結(jié)合程度弱于電活性涂層組(圖4)，可能會影響其骨結(jié)合穩(wěn)定性。

圖3 兩種聚合物涂層鈦植入材料植入兔脛骨缺損術(shù)后4周的硬組織檢測結(jié)果(A，B ×4;C,D ×200) A PLLA涂層鈦表面 B BTO/P(VDF-TrFE)涂層鈦表面 C PLLA涂層鈦表面 D BTO/P(VDF-TrFE)涂層鈦表面 E 骨結(jié)合率;C和D分別為A和B中虛線框區(qū)域的放大圖片，黃色虛線為鈦基底與涂層界面，綠色虛線為涂層與新骨界面

圖4 兩種聚合物涂層鈦植入材料植入兔脛骨缺損術(shù)后12周的硬組織檢測結(jié)果 A PLLA涂層鈦植入材料 B BTO/P(VDF-TrFE)涂層鈦植入材料。黃色虛線為鈦基底與涂層界面，綠色虛線為涂層與新骨界面(×200)

討 論

骨結(jié)合是評價種植修復(fù)效果的金標(biāo)準(zhǔn)，材料性能直接決定植入體骨結(jié)合效果。以往大量研究主要集中于對植入體材料表面的拓撲結(jié)構(gòu)、表面粗糙度、表面親疏水性設(shè)計及活性因子的負載等，仍然無法滿足目前的臨床需求。因此，開發(fā)更為有效的促進植入體材料骨結(jié)合效果的材料設(shè)計策略成為當(dāng)前植入體材料功能化設(shè)計的主要發(fā)展方向。

骨組織處于電磁環(huán)境中，電磁環(huán)境對組織修復(fù)與功能維持起到關(guān)鍵作用[11-13]。基于這一理論背景，相繼有利用電刺激成功治療骨折愈合和骨不連的病例報道[14-17]。骨“壓電效應(yīng)”的提出為電刺激成骨的進一步研究奠定了重要理論基礎(chǔ)。國內(nèi)外學(xué)者針對骨骼的電學(xué)特性和電刺激成骨開展了大量的實驗研究。電刺激可促進骨形成，骨折愈合，促進骨骼的生長和發(fā)育，并且在臨床上得到證實與應(yīng)用。對于骨再生修復(fù)研究，骨組織的天然壓電特性在骨重建修復(fù)過程中的關(guān)鍵作用為人工骨修復(fù)支架材料的仿生電學(xué)設(shè)計提供了思路。

近年來，大量的壓電材料逐漸應(yīng)用于骨修復(fù)支架材料領(lǐng)域，并取得了長足的發(fā)展。如鈦酸鋇壓電陶瓷、鈮酸鉀鈉無鉛壓電陶瓷、聚偏氟乙烯壓電聚合物等作為主要成分的電響應(yīng)性活性材料，大量體內(nèi)外研究證實了這些材料具有良好生物相容性和骨誘導(dǎo)功能[18-20]。如最早提出的用羥基磷灰石/鈦酸鋇(HABT)作為骨修復(fù)支架材料[21]，植入犬下頜骨后，組織學(xué)觀察結(jié)果顯示HABT較純HA有更為明顯的骨生長和愈合程度，并且在HABT植入材料周圍有大量有序排列的膠原形成，提示HABT復(fù)合材料的壓電活性對骨再生產(chǎn)生了關(guān)鍵作用。隨后在鈦酸鋇/羥基磷灰石壓電復(fù)合陶瓷材料方面也取得了系列成果[22-23]。在鈦酸鋇和聚偏氟乙烯PVDF復(fù)合壓電活性材料方面，從材料設(shè)計、體外細胞響應(yīng)，到體內(nèi)促進成骨一系列研究證實了電活性材料在骨缺損修復(fù)過程中的有效性和可行性[24-25]。

然而，以上材料在結(jié)構(gòu)設(shè)計方面存在陶瓷顆粒分散性差導(dǎo)致的材料電學(xué)均勻性、穩(wěn)定性差以及由此造成的臨床效果不穩(wěn)定等不足。更重要的是并沒有從根本上進行仿生電生理效應(yīng)這一角度出發(fā)來進行材料的電響應(yīng)性設(shè)計。本研究前期已經(jīng)成功制備出具有仿生電生理效應(yīng)的BaTiO3/P(VDF-TrFE)納米復(fù)合膜材料并對該材料體系的理化特性包括力學(xué)性能、表面結(jié)構(gòu)、親疏水性、電學(xué)特征以及電學(xué)穩(wěn)定性等進行了系列評價與優(yōu)化，實現(xiàn)了仿生電活性BaTiO3/P(VDF-TrFE)納米復(fù)合膜材料的穩(wěn)定可控制備，并通過體外細胞實驗、體內(nèi)動物實驗證實了該材料促進骨再生與修復(fù)的有效性[9-10]。

本研究進一步將仿生電活性BaTiO3/P(VDF-TrFE)納米復(fù)合材料技術(shù)用于鈦植入材料的表面涂層改性，以增強植入體的骨結(jié)合效果。首先將鈦表面進行噴砂-酸蝕處理是為了增加材料表面粗糙度以更好地與涂層結(jié)合。兩種不同涂層的表面粗糙度、親疏水性均無明顯差異，說明兩者之間的生物學(xué)性能差異主要來自于材料的電學(xué)特性；且經(jīng)過壓電性能測試證實了BTO/P(VDF-TrFE)涂層良好的仿生電學(xué)特性和穩(wěn)定性。此外，在前期報道中已對鈦酸鋇/聚偏氟乙烯三氟乙烯壓電納米復(fù)合膜的電學(xué)特性進行了系統(tǒng)評價，結(jié)果顯示該納米復(fù)合膜具有生理量級的表面電位(約-76.8 mV)，而且在體內(nèi)外均呈現(xiàn)出良好的電學(xué)穩(wěn)定性[9-10]。

在設(shè)計植入體表面涂層材料時，涂層材料的穩(wěn)定性直接決定了植入體骨結(jié)合效果和長期穩(wěn)定性。本研究選取的BTO/P(VDF-TrFE)電活性涂層屬于不可降解材料，植入體內(nèi)后材料具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，能夠保持長期穩(wěn)定的電學(xué)特性。這可能是動物實驗結(jié)果所呈現(xiàn)良好骨結(jié)合效果的重要原因。而PLLA涂層由于PLLA植入體內(nèi)后會發(fā)生緩慢降解，尤其在植入后期會由于材料降解影響骨結(jié)合效果。本研究結(jié)果提示，在植入體材料的表面功能化設(shè)計中，應(yīng)兼顧材料功能特性和材料本身的穩(wěn)定性。

綜上所述，仿生電活性BaTiO3/P(VDF-TrFE)可能作為一種具有促進骨整合功能的種植體涂層材料。