西黃丸對大鼠乳腺癌癌前病變的阻斷作用及對NF-κB蛋白表達(dá)的影響

李德輝 蘇伊璠 范煥芳 孫春霞 韓長輝 馬盼 閆嬌嬌 呂素君

(河北中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

乳腺癌發(fā)病率和死亡率居全球女性惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅女性身體健康和生命安全〔1〕。現(xiàn)代研究證實(shí)，乳腺癌的發(fā)生經(jīng)歷“正常細(xì)胞→單純性增生→非典型增生→原位癌→浸潤性癌”的連續(xù)病變過程，癌前病變是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)階段，而在該階段采取積極的干預(yù)措施可以阻斷甚至逆轉(zhuǎn)癌變進(jìn)程〔2〕。干預(yù)乳腺癌癌前病變，阻斷其向乳腺癌發(fā)展，是目前防治乳腺癌的研究關(guān)鍵。乳腺癌癌前病變屬于中醫(yī)“乳癖”范疇，痰毒瘀結(jié)是其發(fā)生發(fā)展的核心病機(jī)。經(jīng)典名方西黃丸具有清熱解毒、化痰散結(jié)、活血化瘀、消腫止痛之功效，經(jīng)臨床實(shí)踐用于治療乳腺癌癌前病變、防治乳腺癌療效顯著〔3〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，西黃丸浸提液可抑制乳腺癌癌前病變細(xì)胞活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與其抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路mTOR與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白的表達(dá)相關(guān)。本研究以7,12-二甲基苯并蒽(DMBA)協(xié)同雌孕激素序貫方法復(fù)制SD大鼠乳腺癌癌前病變模型，觀察西黃丸對模型大鼠乳腺癌癌前病變的阻斷作用及對核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動物 6周齡SPF級健康未育SD雌性大鼠60只，體重(180±20)g，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：1705351，自由進(jìn)食、飲水，常規(guī)飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物及試劑 苯甲酸雌二醇注射液，寧波第二激素廠生產(chǎn)；黃體酮注射液，寧波第二激素廠生產(chǎn)；枸櫞酸他莫昔芬片，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：17041311；DMBA，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(TCI)，CAS57-97-6；西黃丸，浙江天一堂藥業(yè)有限公司，批號：1703011；NF-κB鼠單克隆抗體，美國Abcam公司。DMBA配制：精密稱取DMBA，按7 mg/ml比例溶于芝麻油，置于60℃水浴箱，超聲振蕩溶解備用。西黃丸水溶液制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，實(shí)驗(yàn)前一天將西黃丸浸泡于少許蒸餾水中，以恰能浸泡藥物顆粒為準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日將浸泡軟的西黃丸碾碎，用蒸餾水配制成濃度分別為27 mg/ml、55 mg/ml、137 mg/ml的西黃丸水溶液備用。他莫昔芬水溶液配制：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用蒸餾水配制成0.4 mg/ml的他莫昔芬水溶液。

1.3儀器 ASP200S全自動組織脫水機(jī)，德國徠卡公司；EG11508組織包埋機(jī)，德國徠卡公司；RM2255全自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國徠卡公司；LEICA DMRA2照像顯微鏡，德國徠卡公司；Leica Qwin 圖像分析系統(tǒng)，德國徠卡公司。

1.4動物模型復(fù)制〔5〕實(shí)驗(yàn)第1天用溶解有DMBA的芝麻油，按1 ml/100 g比例給大鼠一次性灌胃。第2天起，按照5 d為1個周期〔第1～3天，大鼠后腿內(nèi)側(cè)注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/(kg·d)；第4天，大鼠后腿內(nèi)側(cè)注射黃體酮4 mg/(kg·d)；第5天觀察〕，連續(xù)12個周期，建立乳腺癌癌前病變大鼠模型。

1.5分組及給藥方法 按體重分層隨機(jī)分組法將60只大鼠分為正常對照組10只、疾病模型組50只。給藥方法分別如下：正常對照組：一次性灌胃不含DMBA的芝麻油1 ml/100 g，常規(guī)飼養(yǎng)；疾病模型組：按1.4造模方法復(fù)制模型，常規(guī)飼養(yǎng)。10 w造模成功后，將疾病模型組造模成功大鼠按照體重分層隨機(jī)分組法分為疾病模型組，他莫昔芬組，西黃丸低、中、高劑量組共5組，每組10只，給藥方法如下：疾病模型組：常規(guī)飼養(yǎng)；他莫昔芬組：給予他莫昔芬水溶劑(4 mg/kg)1 ml/100 g灌胃，每天1次，連續(xù)28 d，常規(guī)飼養(yǎng)。西黃丸低、中、高劑量組：分別給予西黃丸水溶劑低(270 mg/kg)、中(550 mg/kg)、高劑量(1 370 mg/kg)1 ml/100 g灌胃，每天1次，連續(xù)28 d，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6標(biāo)本采集 于動物實(shí)驗(yàn)過程的第14周末為取材時間點(diǎn)。取材前各組大鼠禁食不禁水24 h，以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉后。無菌條件下取大鼠胸腹部6對乳腺及其周圍皮膚、皮下組織約1.0 cm×1.0 cm。中性甲醛固定，用于蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化檢測。

1.7大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)觀察 取各組大鼠6對部分乳房，用10%甲醛固定，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋切片(厚4 μm)。常規(guī)HE染色，參照文獻(xiàn)在光鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察其增生程度〔6〕。

1.8大鼠乳腺組織NF-κB蛋白表達(dá)的檢測 取各組大鼠第2對部分乳房，用10%甲醛固定，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋切片(厚4 μm)。用免疫組化法檢測大鼠乳腺組織NF-κB蛋白的表達(dá)，按免疫組織化學(xué)SP法操作技術(shù)常規(guī)進(jìn)行，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。以已知NF-κB陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。NF-κB陽性表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：NF-κB陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒，偶見于胞核呈棕黃色。使用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)對NF-κB蛋白表達(dá)的陽性面積和平均光密度進(jìn)行定量分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1西黃丸可阻斷、逆轉(zhuǎn)乳腺癌前病變大鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)變化 各組大鼠乳腺組織增生程度不同(χ2=358.58，P=0.000)，其中疾病模型組增生程度最重，與正常對照組比較，疾病模型組增生程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=14.529，P=0.000)；與疾病模型組比較，他莫昔芬組、西黃丸各劑量組增生程度顯著較低(P<0.05，P<0.01)。見表1，圖1。

表1 西黃丸對乳腺癌前病變大鼠模型乳腺組織病理程度的影響(n=10，n)

圖1 各組乳腺組織病理形態(tài)學(xué)變化(HE，×100)

2.2西黃丸可下調(diào)乳腺癌癌前病變大鼠乳腺組織NF-κB蛋白的表達(dá)水平 與正常對照組比較，疾病模型組NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與疾病模型組比較，他莫昔芬組與西黃丸各劑量組可顯著降低NF-κB蛋白表達(dá)水平(P<0.01，P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組乳腺組織NF-κB蛋白表達(dá)(免疫組化，×200)

表2 西黃丸對乳腺癌癌前病變大鼠模型乳腺組織NF-κB蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

乳腺癌變的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明晰，近年出現(xiàn)的多種關(guān)于該病發(fā)病機(jī)制的理論學(xué)說，如雌激素及其受體介導(dǎo)學(xué)說，孕激素受體介導(dǎo)學(xué)說，細(xì)胞增殖凋亡失衡理論，癌基因、抑癌基因表達(dá)異常學(xué)說，血管生成相關(guān)因子理論等，雖然觀點(diǎn)不一，但都認(rèn)為乳腺癌變的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果。乳腺癌癌前病變動物模型是研究乳腺癌癌前病變病因、發(fā)病機(jī)制、評價治療效果的重要實(shí)驗(yàn)工具，目前乳腺癌癌前病變動物造模方法一般通過自發(fā)性、移植型、誘發(fā)型3種途徑〔7〕。DMBA聯(lián)合雌孕激素序貫建立的乳腺癌癌前病變模型是目前得到普遍認(rèn)可的動物模型之一，DMBA對乳腺組織具有極高的選擇性和特異性(70%～80%)〔8〕，外源性或內(nèi)源性雌孕激素是導(dǎo)致乳腺癌變重要因素，DMBA與雌孕激素聯(lián)合應(yīng)用能夠明顯提高乳腺癌癌前病變的發(fā)生率〔9〕。本項(xiàng)目采用DMBA聯(lián)合雌孕激素序貫成功建立SD大鼠乳腺癌癌前病變模型，陽性對照藥他莫昔芬的給藥劑量通過參照文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定〔10〕，西黃丸劑量參照陳奇〔11〕主編的《中藥藥理研究方法學(xué)》進(jìn)行人與大鼠劑量折算而來。研究結(jié)果表明正常對照組大鼠乳腺組織全部為正常腺體，與正常對照組比較，疾病模型組在第10周時可見同一大鼠的多個乳腺出現(xiàn)不同程度的導(dǎo)管上皮增生和非典型增生，第14周見到較多的Ⅲ級非典型增生及少數(shù)導(dǎo)管內(nèi)癌發(fā)生，此模型經(jīng)過乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞“正?！鷨渭冃栽錾堑湫驮錾话櫺园钡膭討B(tài)發(fā)展過程，與人乳腺癌病變組織病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)非常類似。與疾病模型組比較，他莫昔芬組大鼠乳腺組織增生程度降低，說明他莫昔芬可有效阻斷此模型大鼠乳腺癌前病變的發(fā)生發(fā)展，故此模型是本項(xiàng)目研究的較理想模型。與疾病模型組比較，西黃丸各劑量組大鼠乳腺組織增生程度降低，說明西黃丸可減輕DMBA聯(lián)合雌孕激素序貫誘導(dǎo)的乳腺癌癌前病變大鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

現(xiàn)代藥理研究表明〔3,12〕，西黃丸可通過抑制雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)表達(dá)，逆轉(zhuǎn)P53基因突變，抑制癌基因Bc1-2的過表達(dá)，提高外周血白介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ水平及CD3+、CD4+、免疫共刺激分子B7-1含量，增強(qiáng)免疫清除功能，逆轉(zhuǎn)乳腺癌癌前病變非典型增生的病理變化，阻斷乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，但未見其關(guān)于調(diào)控NF-κB分子方面的報道。在腫瘤細(xì)胞中，NF-κB具有抗凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活的功能。很多研究認(rèn)為〔13,14〕，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中NF-κB的活化起決定性作用，NF-κB蛋白在乳腺癌中的過表達(dá)與組織學(xué)分級有關(guān)，隨著乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，NF-κB蛋白水平在病變?nèi)橄僦械谋磉_(dá)呈動態(tài)增高，說明在乳腺癌變中NF-κB異?；罨?，一定程度上促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究表明NF-κB在模型大鼠乳腺癌癌前病變組織中異?；罨^表達(dá)，西黃丸可下調(diào)乳腺癌癌前病變模型大鼠乳腺組織NF-κB蛋白的表達(dá)。

綜上所述，西黃丸可減輕DMBA聯(lián)合雌孕激素序貫誘導(dǎo)的乳腺癌癌前病變大鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)變化，其機(jī)制可能與其下調(diào)乳腺組織中NF-κB蛋白的表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果進(jìn)一步拓寬了西黃丸治療乳腺癌癌前病變，預(yù)防乳腺癌的作用機(jī)制，為下一步進(jìn)行西黃丸通過抑制NF-κB信號通路阻斷乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的研究提供了基礎(chǔ)。