早期2型糖尿病腎病患者血糖波動(dòng)與氧化應(yīng)激、炎癥及單核細(xì)胞自噬的相關(guān)性

周建華 李曉華 貝鵬劍 徐艷紅 李麗華 朱祎

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200137)

血糖波動(dòng)參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，但機(jī)制尚不完全明了。氧化應(yīng)激和炎癥是糖尿病腎病發(fā)病的重要機(jī)制，而自噬在糖尿病腎病中的作用也受到越來越多的關(guān)注。血糖波動(dòng)通過氧化應(yīng)激引起糖尿病腎臟損傷，關(guān)于血糖波動(dòng)與單核細(xì)胞自噬相關(guān)性的體內(nèi)外研究均尚未見報(bào)道。本研究觀察糖尿病腎病早期患者血糖波動(dòng)與氧化應(yīng)激、炎癥因子及單核細(xì)胞自噬的相關(guān)性，旨在為糖尿病腎病的防治尋找新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1資料 選取2016年11月至2018年11月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的早期2型糖尿病腎病患者120例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。②3 mg/g≤2次尿白蛋白肌酐比(UACR)平均值<30 mg/g。③糖化血紅蛋白(HbA1c)≤7%。④近3個(gè)月未改變降糖方案。⑤無(wú)低蛋白血癥及貧血。⑥排除糖尿病急性并發(fā)癥、嚴(yán)重大血管并發(fā)癥(如心梗、腦梗)及其他可能影響糖代謝(如肺感染、心力衰竭、腎衰竭等)的疾病。⑦排除其他類型的非糖尿病腎病。⑧排除合并高血壓患者。⑨排除近期使用影響糖代謝及抗氧化應(yīng)激藥物的患者。根據(jù)平均血糖波動(dòng)幅度(MAGE)分成兩組：A組：MAGE<3 mmol/L，B組：MAGE≥3 mmol/L。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)與批準(zhǔn)，患者及家屬知情并同意本研究。

1.2主要儀器與設(shè)備 貝克曼5800全自動(dòng)生化分析儀：日本貝克曼公司，全自動(dòng)酶免儀：西班牙Triturus，電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司，轉(zhuǎn)膜儀：美國(guó)Bio-Rad公司，成像儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3主要試劑 人單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定試劑盒：購(gòu)自上海博舜公司，人腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定試劑盒：購(gòu)自上海博舜公司，人白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定試劑盒：購(gòu)自上海博舜公司，尿游離8-異前列腺素(8-isoPG)F2α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman公司，Anti-LC3B抗體：購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.4觀察指標(biāo) 兩組患者均測(cè)量身高、體重、腰圍，計(jì)算體重指數(shù)(BMI)，予動(dòng)態(tài)血糖監(jiān)測(cè)(CGMS)72 h評(píng)估MAGE，外周血檢測(cè)總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹胰島素(FINS)、HbA1c、MCP-1、TNF-α、IL-6、單核細(xì)胞LC3B-Ⅱ水平，留取晨尿監(jiān)測(cè)UACR，24 h尿檢測(cè)8-isoPGF2α。

1.5主要指標(biāo)測(cè)定 血脂分析采用全自動(dòng)生化分析儀，F(xiàn)INS測(cè)定采用電化學(xué)發(fā)光法，HbA1c測(cè)定采用離子交換高效液相色譜分析法，MCP-1、TNF-α、IL-6、8-isoPGF2α測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，外周血單核細(xì)胞LC3B-Ⅱ水平測(cè)定采用Western印跡法。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及多元線性逐步回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1基本資料 兩組性別、HbA1c、FINS、年齡、TC、LDL-C、HDL-C、腰圍對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與A組相比，B組UACR、MAGE、TG、BMI、8-isoPGF2α、MCP-1、IL-6、TNF-α顯著更高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組基本資料比較

2.2多元線性逐步回歸分析UACR影響因素 以UACR為因變量，年齡、MAGE、FINS、TC、LDL-C、TG、HDL-C、BMI、腰圍、8-isoPGF2α、MCP-1、IL-6、TNF-α為自變量，僅MAGE、8-isoPGF2α、MCP-1進(jìn)入最終方程，方程為：UACR=-6.336+7.824 MAGE+0.079 8-isoPGF2α+0.029 MCP-1，其中MAGE與UACR相關(guān)系數(shù)最大。

2.3兩組外周血單核細(xì)胞自噬水平比較 與A組相比，B組LC3B-Ⅱ水平及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明顯下降(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 兩組LC3B Western印跡結(jié)果

表2 兩組外周血單核自噬水平比較

3 討 論

糖尿病腎病是2型糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，它的發(fā)生發(fā)展與血糖波動(dòng)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，在10項(xiàng)2型糖尿病患者的研究中，有9項(xiàng)報(bào)告顯示血糖變異性與糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)展或進(jìn)展顯著正相關(guān)。體外研究結(jié)果顯示，與持續(xù)高葡萄糖處理組相比，間歇性高葡萄糖處理組通過上調(diào)骨橋蛋白的表達(dá)加劇大鼠系膜細(xì)胞增殖和膠原合成〔2〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與持續(xù)高血糖組相比，血糖波動(dòng)組糖尿病大鼠腎小球肥大，毛細(xì)血管基底膜增厚，腎小囊腔擴(kuò)大，基質(zhì)增加，腎小管體積、腎肥大指數(shù)、腎小球硬化指數(shù)和Ⅳ型膠原含量均呈上升趨勢(shì)〔3〕。MAGE目前被認(rèn)為是評(píng)估日內(nèi)血糖波動(dòng)的金標(biāo)準(zhǔn)〔4〕。故本研究選用MAGE作為評(píng)價(jià)血糖波動(dòng)的指標(biāo)。本研究結(jié)果提示，血糖波動(dòng)可能是血糖控制良好的早期2型糖尿病腎病患者的最重要影響因素。

氧化應(yīng)激和炎癥〔5〕是糖尿病腎病發(fā)病的重要機(jī)制。大多研究證實(shí)，血糖波動(dòng)通過氧化應(yīng)激和炎癥引起糖尿病腎臟損傷。Chang等〔6〕研究表明血糖波動(dòng)大的糖尿病患者處于高氧化應(yīng)激及慢性炎癥狀態(tài)。體外研究發(fā)現(xiàn)，急性波動(dòng)性高血糖加劇了內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激及促炎癥因子的表達(dá)〔7〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，血糖波動(dòng)增加了腎組織的氧化應(yīng)激，抑制了蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路，加劇了腎組織超微結(jié)構(gòu)的損害〔8〕。而增加的細(xì)胞內(nèi)活性氧是炎癥的直接激活劑〔9〕。血糖波動(dòng)的減少可以直接降低患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平〔10〕，HbA1c水平的波動(dòng)減少，可降低糖尿病腎病的發(fā)生率〔11〕。而抗氧化及抗炎治療治療也可以改善糖尿病腎臟損傷〔5，12，13〕。8-isoPGF2α為自由基介導(dǎo)的花生四烯酸氧化形成的產(chǎn)物，是反映氧化應(yīng)激的可靠指標(biāo)〔14〕。MCP-1作為重要的炎癥因子〔15〕，是已知最強(qiáng)的趨化因子，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并將巨噬細(xì)胞招募到炎癥部位，并通過產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子而導(dǎo)致局部和全身的炎癥，對(duì)糖尿病腎病的發(fā)展和進(jìn)展具有重要意義。TNF-α由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可以直接誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，同時(shí)還可刺激炎癥細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)，引起“瀑布式”炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔16〕。IL-6可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，可延緩中性粒細(xì)胞的凋亡，使炎癥反應(yīng)持續(xù)存在〔17〕。因此，本研究選用8-isoPGF2α作為氧化應(yīng)激指標(biāo)，MCP-1、TNF-α及IL-6作為炎癥指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，相較于血糖波動(dòng)小組，血糖波動(dòng)大組UACR與8-isoPGF2α及MCP-1、IL-6、TNF-β明顯增高，UACR相關(guān)性分析顯示，MAGE、8-isoPGF2α及MCP-1是UACR獨(dú)立危險(xiǎn)因素，即在早期2型糖尿病腎病患者中，血糖波動(dòng)大組UACR水平及氧化應(yīng)激水平、炎癥因子水平均較血糖波動(dòng)小組更高，且MAGE、氧化應(yīng)激及MCP-1與UACR獨(dú)立相關(guān)，與以往研究一致。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，相較于血糖波動(dòng)小組，血糖波動(dòng)大組TG及BMI更高，考慮可能與高BMI及高TG患者飲食管理相對(duì)較差、餐后血糖管理不佳致血糖波動(dòng)較大有關(guān)，也可能與胰島功能差異有關(guān)〔18〕。前期研究發(fā)現(xiàn)〔18〕，初診2型糖尿病患者的晚相胰島素分泌水平與BMI呈負(fù)相關(guān)，而晚相胰島素分泌水平越低，血糖波動(dòng)越大。然而，在相關(guān)性分析中，并未顯示BMI及TG與UACR相關(guān)，因此，BMI及TG與血糖波動(dòng)的相關(guān)性可能還需要更大樣本量的臨床研究來進(jìn)一步探討。

近年來，自噬在糖尿病腎病中作用受到越來越多的關(guān)注。LC3B-Ⅱ是公認(rèn)的自噬標(biāo)志物〔19〕。大多研究表明，自噬缺陷參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展〔20,21〕，激活自噬可能具有腎保護(hù)作用〔22,23〕。研究表明，單核巨噬細(xì)胞參與了糖尿病腎病早期的腎損傷〔24,25〕，它們通過產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子而導(dǎo)致局部和全身的炎癥〔16,17〕。Menne等〔26〕發(fā)現(xiàn)，MCP-1的抑制劑可降低糖尿病腎病患者的蛋白尿。本研究結(jié)果提示，與血糖波動(dòng)小組比較，血糖波動(dòng)大組外周血單核細(xì)胞LC3B-Ⅱ水平及LC3B-Ⅱ/LC3B-1比值均明顯下降，即自噬活性減弱，并與尿ACR、MAGE、8-isoPGF2α及MCP-1呈負(fù)相關(guān)。一般來說，當(dāng)腎細(xì)胞暴露在包括缺氧、基因毒性損傷、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激條件下時(shí)，自噬被激活，并對(duì)細(xì)胞存活起到關(guān)鍵作用〔27〕。然而，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)壓力仍未解決時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間自噬上調(diào)進(jìn)入自噬缺陷〔28〕。在營(yíng)養(yǎng)或能量過剩的狀態(tài)下，自噬被下調(diào)。盡管這種下調(diào)在短期內(nèi)是有益的，但有缺陷的自噬可能最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷的累積，從而導(dǎo)致代謝性或年齡相關(guān)性腎臟疾病的發(fā)展〔29〕。Fiorentino等〔30〕在一項(xiàng)小樣本的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者活檢腎臟組織參與自噬的山羊組織金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)3、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族(foxo)1和foxo1靶基因顯著減少，而foxo1轉(zhuǎn)錄抑制因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)1表達(dá)顯著增加，即腎組織自噬活性在一定程度上下降。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)〔31〕，高血糖狀態(tài)下，足細(xì)胞的自噬活性隨著自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的降低而降低。急性高葡萄糖暴露可能通過活性氧激活自噬。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在暴露于高葡萄糖下的條件性永生化鼠足細(xì)胞(CIMPs)中，自噬在24 h內(nèi)被誘導(dǎo)，同時(shí)產(chǎn)生活性氧，而抗氧化劑可抑制自噬〔32〕?；钚匝踅閷?dǎo)的自噬作用在用飽和脂肪酸棕櫚酸處理24 h的培養(yǎng)足細(xì)胞中得到進(jìn)一步的觀察〔33〕。這些結(jié)果提示足細(xì)胞對(duì)早期糖尿病的活性氧有積極的自噬作用。然而，高葡萄糖對(duì)足細(xì)胞自噬的影響似乎是時(shí)間依賴性的。Lenoir等〔34〕發(fā)現(xiàn)，24 h后高葡萄糖促進(jìn)原代足細(xì)胞自噬通量，重組人自體吞噬相關(guān)蛋白(Atg)5缺失使足細(xì)胞對(duì)高葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，在穩(wěn)定的足細(xì)胞系SVI細(xì)胞中，48 h后高葡萄糖誘導(dǎo)自噬，15 d后自噬被抑制。Tagawa等〔35〕進(jìn)一步證實(shí)足細(xì)胞自噬功能不全在晚期糖尿病腎病中起關(guān)鍵作用。近年來，越來越多的證據(jù)支持自噬在炎癥中的作用〔36,37〕。自噬缺陷能誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB介導(dǎo)的炎癥〔38〕。自噬可以調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Alizadeh等〔39〕發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病患者中，雷帕霉素靶蛋白(mtor)信號(hào)通路的激活導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞自噬減少，炎癥因子表達(dá)增加。氧化應(yīng)激可能介導(dǎo)了自噬缺陷促進(jìn)的炎癥發(fā)生。Liu等〔9〕發(fā)現(xiàn)，自噬阻滯導(dǎo)致受損的、產(chǎn)生活性氧的線粒體堆積，從而激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRP)3炎癥小體。NLRP3的炎癥活性受自噬的負(fù)調(diào)節(jié)，而由非特征性細(xì)胞器產(chǎn)生的活性氧的正調(diào)節(jié)。基于以上血糖波動(dòng)與氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)性及自噬與氧化應(yīng)激及炎癥的相關(guān)性，推測(cè)在早期的糖尿病腎病患者中，急性血糖波動(dòng)引起氧化應(yīng)激，激活單核細(xì)胞自噬，減少M(fèi)CP-1釋放，起到一定的腎臟保護(hù)作用，而持續(xù)的血糖波動(dòng)引起的持續(xù)的氧化應(yīng)激，最終仍導(dǎo)致單核細(xì)胞的自噬缺陷，MCP-1分泌增加，加之血糖波動(dòng)及氧化應(yīng)激本身刺激的MCP-1分泌，腎臟炎性損傷加重，蛋白尿增加。但因本研究樣本量較小及臨床研究的局限性，具體的通路機(jī)制及研究結(jié)果仍需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)來揭示和證實(shí)。

綜上所述，在早期2型糖尿病腎病患者中，持續(xù)的血糖波動(dòng)可能通過持續(xù)的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞的自噬缺陷，MCP-1分泌增加及血糖波動(dòng)及氧化應(yīng)激本身刺激的MCP-1分泌，參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。因此，在糖尿病腎病的防治中，除了減少血糖波動(dòng)、抗氧化治療及抗炎治療，適當(dāng)?shù)淖允杉せ羁赡苁且粋€(gè)新的方向。然而，血糖波動(dòng)導(dǎo)致自噬缺陷的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。