一株暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的分離與培養(yǎng)基優(yōu)化

HASSAN Sidik Mohamed，郭旭新，吳崢妍，潘晨晨，徐孟濤，柳永,2,3*

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023； 2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310023;3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023)

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌[Phlebopusportentosus(Berk.& Broome)Boedi jn.]俗稱黑牛肝菌，屬小牛肝菌科(Boletinellaceae)脈柄牛肝菌屬(Phlebopus)可食用真菌[1]，味道鮮美、價格昂貴。自然條件下，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌可與鳳凰木、菠蘿蜜、柚子、咖啡等多種植物形成外生菌根[2]。弱酸性(均值6.04)和高速效鉀土壤(均值231.17 mg·kg-1)有利于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌出菇[3]。人工平板菌絲培養(yǎng)條件下，葡萄糖、酵母膏、KH2PO4和MgSO4分別是暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的最適碳源、氮源和無機(jī)鹽[4]；深層液態(tài)培養(yǎng)條件下甘露醇和酵母膏分別為其最適碳源和氮源[5]。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌生產(chǎn)母種優(yōu)選培養(yǎng)基為添加1.0 g·L-1MgSO4、1.0 g·L-1KH2PO4和2.0 g·L-1酵母膏的改良PDA培養(yǎng)基[6]，但繼代次數(shù)不宜超過2次[7]。

國內(nèi)人工栽培研究表明，在穩(wěn)定的栽培模式下，袋栽暗褐網(wǎng)柄牛肝菌鮮品產(chǎn)量可達(dá)100 g·袋-1，出菇周期60 d左右。出菇后的廢菌渣可于林下仿生栽培，第2年每667 m2產(chǎn)鮮菇60 kg左右[8]。人工覆土以全碳、總磷較高的菜園土為佳，出菇數(shù)量和單菇質(zhì)量均得到顯著提高[9]。泰國Kumla等[10]和Sanmee等[11]分別以高粱粉-宿主營養(yǎng)液-草粉和橡膠樹粉-米糠等復(fù)配物料實現(xiàn)了暗褐網(wǎng)柄牛肝菌成功出菇，但離產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用尚遠(yuǎn)。

大量菌根菌與宿主植物通過“碳水化合物和磷交易”的方式實現(xiàn)互利共生，在森林地下碳水化合物和磷的運(yùn)輸與交換中發(fā)揮著重要作用[12]。同時，菌根菌是13C標(biāo)記光合產(chǎn)物的首要受體，且6 d后系統(tǒng)內(nèi)剩余13C標(biāo)記光合作用產(chǎn)物中的26.8%被轉(zhuǎn)移到地下[13]。作為外生菌根菌家族的一員，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌極有可能在自然界中扮演著相似的角色，與宿主植物間擁有豐富的互動[14]。在從宿主獲取營養(yǎng)物質(zhì)的同時，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌如何感知季節(jié)的變化，進(jìn)而完成子實體發(fā)育呢？植物體內(nèi)伴隨季節(jié)波動的激素水平，是否可能為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌感知適宜繁殖季節(jié)的到來提供“信號”呢？本文介紹了暗褐網(wǎng)柄牛肝菌對幾種常見天然營養(yǎng)物和植物生長調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)性測試結(jié)果，希望能為后續(xù)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的栽培應(yīng)用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體采自云南省木水花野生菌批發(fā)市場(昆明市)，PDA培養(yǎng)基購自杭州百思生物公司，全土豆粉購自甘肅正陽農(nóng)業(yè)科技公司，酵母抽提物購自O(shè)XOID公司，小牛浸膏購自杭州微生物試劑有限公司，活性炭購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，鮮蛋黃為市售鮮雞蛋的蛋黃，小麥麩皮、花生秸稈粉、毛竹粉、楊木屑分別來自安徽省淮南市、山東省萊蕪市、浙江省安吉縣和江蘇省連云港市。MgSO4、KH2PO4、維生素B1(VB1)、葡萄糖、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純，瓊脂粉購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑公司。脫落酸(ABA)、細(xì)胞分裂素類植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、生長素類植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-D均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌種分離與鑒定

取暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體1個，用75%乙醇棉擦拭表面后，切開菌柄，從斷面處挖取組織小塊，接種于改良PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)15 d左右即可獲得分離株。改良PDA培養(yǎng)基配方：PDA粉末 46.1 g·L-1，全土豆粉30 g·L-1，硫酸鎂1.5 g·L-1，磷酸二氫鉀3 g·L-1，VB110 mg·L-1，瓊脂10 g·L-1，pH 6.8。121 ℃高壓滅菌30 min，倒平板備用。分離株采用ITS序列對比法進(jìn)行分子鑒定，DNA提取方法為FDEB法[15]。ITS擴(kuò)增引物為ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，16 ℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLASTn序列比對，選取相似度99%以上序列的菌種信息作為分離株物種鑒定結(jié)果。

1.3 天然物料對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌分離株生長速度的影響

選取長勢健壯的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌分離株DN18開展后續(xù)生長性能研究。DN18在改良PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，推測可能與缺乏某種營養(yǎng)成分有關(guān)。在改良PDA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加6 g·L-1酵母抽提物(PDY)、小牛浸膏(PDB)、活性炭(PDC)、鮮蛋黃(PDE)、小麥麩皮(PDF)、花生秸稈粉(PDG)、毛竹粉(PDM)和楊木屑(PDW)，配制成8種固體培養(yǎng)基。接種DN18菌種后于28 ℃培養(yǎng)28 d，觀察暗褐網(wǎng)柄牛肝菌長勢。

1.4 6-BA、ABA、2,4-D對菌絲長勢的影響

在固體改良PDA培養(yǎng)基中，分別添加2、3、5 mg·L-1的6-BA、ABA或2,4-D。各處理制備5個固體培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基量約為20 mL。接種DN18后于28 ℃培養(yǎng)28 d，測量和統(tǒng)計各平皿中DN18菌落直徑和菌囊數(shù)量，計算平均值。

1.5 植物生長調(diào)節(jié)劑對菌絲長勢的影響

在改良固體PDA培養(yǎng)基中，分別添加不同比例的6-BA和2,4-D或6-BA和ABA，6-BA與2,4-D或ABA的質(zhì)量比分別為1∶1、2∶1、4∶1、8∶1。其中，6-BA質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)固定為4 mg·L-1，根據(jù)比例關(guān)系分別添加適量2,4-D或ABA。菌絲生長速度測定和菌囊數(shù)量統(tǒng)計方法同1.4節(jié)所述。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌分離株鑒定

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌組織分離與ITS序列擴(kuò)增結(jié)果見圖1。圖1中，A為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體外觀與橫切面； B圖中箭頭所示為子實體根部的菌囊樣結(jié)構(gòu)，可能與子實體分化有關(guān)，后續(xù)培養(yǎng)基篩選中把菌囊形成數(shù)量納入考量指標(biāo)之一；C圖為DN18分離株，其生長旺盛，菌落邊緣整齊；D圖中M1為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000，1號泳道是基因組DNA提取結(jié)果，條帶規(guī)則，無明顯拖尾，提取效果良好；E圖中4號為DN18 ITS擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶單一明亮，大小介于500～800 bp。測序結(jié)果與Genbank收錄的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的ITS序列具有99%相似度，判斷分離株DN18為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌(Phlebopusportentosus)。

A為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體外觀與橫切面； B圖中箭頭所示為子實體根部的菌囊樣結(jié)構(gòu)；C圖為DN18分離株；D圖中M1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000，1號泳道是基因組DNA提取結(jié)果；E圖中4號為DN18 ITS擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 暗褐網(wǎng)柄牛肝菌組織分離株及其ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 添加物對DN18長勢的影響

改良PDA培養(yǎng)基中額外添加活性炭、花生秸稈粉、酵母抽提物、鮮蛋黃、毛竹粉、小牛浸膏、小麥麩皮和楊木屑后，DN18菌落外觀見圖2。從圖2可以看出，9種培養(yǎng)基上DN18的生長速度和菌落顏色等均有一定差異。生長速度方面，PDW=PDG>PDM=PDB>PDF>PDC>改良PDA=PDE>PDY；菌落顏色方面，PDF、PDG、PDW培養(yǎng)基上DN18菌落顏色均呈暗褐色；PDM培養(yǎng)基上，菌落中部呈深褐色，外圍顏色仍為黃色；其他培養(yǎng)基上菌落顏色以黃色為主。

PDY、PDB、PDC、PDE、PDF、PDG、PDM、PDW分別為添加酵母抽提物、小牛浸膏、活性炭、鮮蛋黃、小麥麩皮、花生秸稈粉、毛竹粉和楊木屑的改良PDA培養(yǎng)基。圖2 DN18在9個培養(yǎng)基上的菌落形貌

2.3 單一植物生長調(diào)節(jié)劑對DN18長勢的影響

DN18在添加植物激素培養(yǎng)基上的生長速度和菌囊數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果見表1，菌落形態(tài)見圖3。從表1可以看出：添加2、3、5 mg·L-1ABA未表現(xiàn)出促進(jìn)DN18生長的效應(yīng)；6-BA和2,4-D促進(jìn)了DN18菌絲體生長，尤其5 mg·L-12,4-D和3 mg·L-16-BA促進(jìn)DN18生長效應(yīng)較為突出。5 mg·L-12,4-D較無激素對照(改良PDA培養(yǎng)基)生長速度提高了37.3%。此外，添加6-BA和2,4-D對菌落顏色有一定影響，添加濃度越高，菌落顏色越深(圖3)。

表1 3種外源激素處理下DN18長勢

圖3 DN18在不同植物激素培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

從表2和圖4可以看出，6-BA、2,4-D質(zhì)量比為1∶1時，DN18生長速度快于其他處理組，與單獨添加5 mg·L-12,4-D效果相當(dāng)。6-BA、ABA質(zhì)量比為4∶1、8∶1時，菌囊數(shù)量明顯增多。菌絲生長速度與菌囊數(shù)量沒有明顯關(guān)聯(lián)，菌囊的生物學(xué)意義還有待后續(xù)挖掘。

表2 DN18在混合植物激素培養(yǎng)基上的生長情況

3 討論

對比PDF和PDG培養(yǎng)基成分可以發(fā)現(xiàn)，PDF中小麥麩皮蛋白質(zhì)含量(12%～18%)[16]高于PDG中花生秸稈蛋白質(zhì)含量(6.6%～11.6%)，PDF中非淀粉多糖含量(46%左右)[17]低于PDG中花生秸稈的中性與酸性洗滌纖維含量(65%～81%)[18]。結(jié)合DN18在富含蛋白質(zhì)營養(yǎng)的PDY和PDB培養(yǎng)基上的長勢，可以推測蛋白質(zhì)并非DN18在改良PDA培養(yǎng)基上生長的主要限制營養(yǎng)因子。厚壁毛竹中棕纖維含量約為46%～56%[19]，均低于花生秸稈粉和楊木屑的蛋白質(zhì)含量[20]，但與小麥麩皮中較低的非淀粉多糖含量(46%左右)接近，由此推測，導(dǎo)致菌落顏色呈暗褐色的因素可能是非淀粉多糖中的某一類組分。從圖3中5 mg·L-16-BA、3 mg·L-1ABA、5 mg·L-12,4-D與其他處理的菌落顏色差異，以及圖4中6-BA、BA質(zhì)量比2∶1處理突出的深褐色菌落可以發(fā)現(xiàn)，DN18的菌落顏色與激素水平有關(guān)。同時大量研究表明，在菌根菌與其宿主植物間的共生關(guān)系中，激素調(diào)控扮演著極為重要的作用。一方面，外生菌根真菌可以產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)和細(xì)胞分裂素等植物激素[21]，在菌根共生關(guān)系形成過程中，對植物根部的發(fā)育產(chǎn)生影響。另一方面，菌根菌的生長特性也受到植物激素的調(diào)控：GAs在菌根共生關(guān)系建立中扮演負(fù)調(diào)控因子，外源施加活性GA3時，叢植菌根菌的分支減少；ABA在低濃度下促進(jìn)菌根菌在植物根部的定殖，高濃度下同樣具有降低叢枝菌根菌分支數(shù)量的效應(yīng)。在楊樹和番茄外生菌根菌研究中發(fā)現(xiàn)，菌根真菌能誘導(dǎo)根尖生長素的累積，菌根和生長素共同調(diào)控植物的生長發(fā)育[22]。當(dāng)前的菌根共生關(guān)系研究中，默認(rèn)以植物為中心研究對象，作為地下物質(zhì)交換中心的菌根菌則被忽視，植物激素對菌根菌生長發(fā)育的影響鮮有研究。菌根類食用菌分離難、栽培難或許就與栽培介質(zhì)中缺乏某些重要植物源活性因子有關(guān)。

圖4 DN18在混合植物激素培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)