干細(xì)胞治療薄型子宮內(nèi)膜的研究進(jìn)展

崔皓，轉(zhuǎn)黎，馬艷萍

(1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明650000； 2.云南省第一人民醫(yī)院 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，昆明650032)

子宮內(nèi)膜過薄可導(dǎo)致胚胎種植率、臨床妊娠率或活產(chǎn)率顯著降低，進(jìn)而導(dǎo)致體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)治療周期取消、反復(fù)種植失敗甚至不孕癥等[1]。子宮內(nèi)膜過薄主要與雌激素、孕激素水平較低以及長期服用口服避孕藥、反復(fù)刮宮等有關(guān)[2-4]，其主要病理生理機(jī)制包括子宮內(nèi)膜纖維化面積增加、腺體數(shù)量減少、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)水平較低以及血流量減少等[5]。目前，薄型子宮內(nèi)膜的治療方法主要集中于外源性雌激素補(bǔ)充以及低劑量阿司匹林、左旋精氨酸、枸櫞酸西地那非、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)等宮腔內(nèi)灌注，但現(xiàn)有的治療方法并不能從根本上解決子宮內(nèi)膜再生的問題[1,6]。干細(xì)胞是一類具有無限自我更新并可以增殖分化為多種細(xì)胞類型的原始細(xì)胞，可促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生，從而改善子宮內(nèi)膜的厚度和容受性。干細(xì)胞治療用于子宮內(nèi)膜再生修復(fù)顯示出良好的前景?，F(xiàn)就干細(xì)胞治療薄型子宮內(nèi)膜的研究進(jìn)展予以綜述，以為薄型子宮內(nèi)膜干細(xì)胞治療的細(xì)胞選擇提供依據(jù)。

1 干細(xì)胞

干細(xì)胞最初是未分化的細(xì)胞，無明顯的形態(tài)特征，具有無限自我更新和增殖分化為多種細(xì)胞類型的能力[7]。干細(xì)胞為身體所有組織和器官系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)，并在宿主的疾病進(jìn)展、發(fā)育和組織修復(fù)過程中發(fā)揮多種作用。自1981年在小鼠身上建立了第一個(gè)胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)以來[8]，干細(xì)胞的研究取得了很大進(jìn)展?；谵D(zhuǎn)化和分化潛能，干細(xì)胞分為單能型干細(xì)胞、專能型干細(xì)胞、多能型干細(xì)胞和全能型干細(xì)胞[9]。干細(xì)胞治療包括治療遺傳疾病以及產(chǎn)生新的干細(xì)胞衍生的人體組織和生物材料，并用于再生醫(yī)學(xué)和藥物基因組學(xué)。在理想情況下，用于再生醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①可以大量被發(fā)現(xiàn)(數(shù)百萬至數(shù)十億個(gè)細(xì)胞)；可以通過微創(chuàng)手術(shù)獲得；②可以通過調(diào)節(jié)和復(fù)制的方式沿多個(gè)細(xì)胞譜系分化；③可以安全有效地移植到自體或異源宿主中；④可以根據(jù)現(xiàn)行的良好生產(chǎn)規(guī)范指南進(jìn)行生產(chǎn)[10]。

從目前已完成和正在進(jìn)行的臨床研究中獲得的結(jié)果表明，干細(xì)胞療法對于治療退行性、自身免疫疾病和遺傳性疾病有巨大的潛能[11-12]。然而，倫理問題、可能的致瘤性以及分化組織排斥的風(fēng)險(xiǎn)限制了其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。

2 薄型子宮內(nèi)膜

人類子宮內(nèi)膜是一種高度再生的組織，在女性生殖年齡經(jīng)歷了400多個(gè)周期的形成、發(fā)育和脫落。子宮內(nèi)膜主要由上皮細(xì)胞(包括腔細(xì)胞和腺細(xì)胞)和間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。在組織學(xué)中，子宮內(nèi)膜由基底層和功能層構(gòu)成，功能層由致密的腺組織和松弛的結(jié)締組織組成，而間質(zhì)是基底肌內(nèi)層的主要部分；在月經(jīng)期，功能層和一小部分基底層脫落，而功能層的重建對于組織擴(kuò)張至關(guān)重要，負(fù)責(zé)著床和月經(jīng)[13]。當(dāng)子宮內(nèi)膜發(fā)生炎癥時(shí)，抗子宮內(nèi)膜抗體可能轉(zhuǎn)化為抗原或者半抗原，并刺激子宮內(nèi)膜產(chǎn)生抗體對機(jī)體進(jìn)行保護(hù)，但這種免疫機(jī)制啟動(dòng)時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致不孕、停孕或流產(chǎn)等情況的發(fā)生[14]。

薄型子宮內(nèi)膜(<7 mm)阻礙受精卵在子宮內(nèi)膜著床和發(fā)育[15]。目前，薄型子宮內(nèi)膜的治療方法對于子宮內(nèi)膜嚴(yán)重創(chuàng)傷和Asherman綜合征等難治性薄型子宮內(nèi)膜患者無效，并由此導(dǎo)致不孕、IVF-ET治療周期取消、無期限胚胎冷凍及反復(fù)種植失敗，更嚴(yán)重的為代孕[1,6,16]。子宮血流量低和血管生成受損被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜薄的原因[17]。血管生成是參與女性生殖過程一個(gè)關(guān)鍵因素，如黃體的形成、卵泡的發(fā)育和子宮內(nèi)膜的生長，而VEGF水平低、子宮內(nèi)膜血流降低導(dǎo)致血管擴(kuò)張不良[18]。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial stem cells，EnSCs)數(shù)量或功能失調(diào)也可能是薄型子宮內(nèi)膜發(fā)生或Asherman綜合征的原因之一[19-20]。

3 干細(xì)胞治療薄型子宮內(nèi)膜

目前，主要用于治療薄型子宮的干細(xì)胞有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、骨髓來源的CD45+造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、EnSCs、ESCs、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)等，見表1。干細(xì)胞可通過其無限自我更新和增殖分化的能力促進(jìn)子宮內(nèi)膜的再生修復(fù)，顯示出治療薄型子宮內(nèi)膜的良好前景。

表1 干細(xì)胞在子宮內(nèi)膜再生中的作用

3.1BMSCs BMSCs是一種具有無限自我更新、多向分化、自體移植特性且無免疫排斥的一類成體干細(xì)胞[21-23]。BMSCs可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌腱細(xì)胞和成肌細(xì)胞[24]。由于BMSCs的增殖能力更高，并且較成熟的成骨細(xì)胞更容易獲得，因此已被確定為促進(jìn)骨修復(fù)的最佳祖細(xì)胞來源[25]。

BMSCs在特定誘導(dǎo)條件下可以分化為神經(jīng)外胚層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞。目前，BMSCs被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植治療薄型子宮內(nèi)膜的研究且效果較為肯定。BMSCs移植可顯著增加薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型及Asherman綜合征患者的子宮內(nèi)膜厚度并改善其纖維化面積，一方面通過干細(xì)胞種植定向分化為子宮內(nèi)膜而參與受損子宮內(nèi)膜組織修復(fù)和重構(gòu)；另一方面通過免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)和旁分泌細(xì)胞因子促進(jìn)組織血管重構(gòu)及激活內(nèi)源性EnSCs，不僅可有效保護(hù)細(xì)胞損傷和促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生，并且可以改善子宮內(nèi)膜容受性甚至恢復(fù)生育功能，但具體機(jī)制目前尚未明確，可能為：①通過定向分化為子宮內(nèi)膜細(xì)胞、增強(qiáng)波形蛋白、細(xì)胞角蛋白、整合素αVβ3和白血病抑制因子，下調(diào)促炎細(xì)胞因子[如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2、MMP-9、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-17)]以及上調(diào)抗炎細(xì)胞因子(如堿性成纖維細(xì)胞生長因子、VEGF、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10)的表達(dá)，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生修復(fù)；②通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜新生血管生成及改善子宮內(nèi)膜局部血流量，達(dá)到從組織學(xué)水平治療薄型子宮內(nèi)膜的目的[26-32]。此外，Ikoma等[33]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的CD45+HSCs可能是大多數(shù)妊娠子宮新上皮細(xì)胞的來源。CD45+HSCs位于紅骨髓中，也存在于臍帶血中，少量存在于外周血中，在有、無生育能力的婦女子宮內(nèi)膜樣本中，HSCs的數(shù)量相似。在臨床上，Santamaria等[34]研究表明，患者經(jīng)激素替代法治療后，再通過自體CD133+BMSCs治療月經(jīng)立即恢復(fù)，并在第3個(gè)月月經(jīng)量有所增加。

在臨床上，BMSCs用于治療薄型子宮內(nèi)膜的研究已取得了顯著療效，其易于體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化且無倫理問題及免疫排斥反應(yīng)。但BMSCs來源有限，每個(gè)成人只能抽取10～20 mL骨髓，而且骨髓的抽取因給患者造成極大的痛苦而不易被接受，加之BMSCs的分化潛能與年齡呈負(fù)相關(guān)[35]，因此限制了其臨床廣泛應(yīng)用的可能性。

3.2EnSCs 人類子宮內(nèi)膜是一種高度活躍的組織，子宮內(nèi)膜再生的本質(zhì)是在類固醇激素調(diào)控下一系列細(xì)胞生長因子及信號(hào)分子參與的EnSCs增殖、分化和遷移的過程[20]。Prianishnikov[36]于1978年首次推測子宮內(nèi)膜中存在干細(xì)胞。EnSCs是一類具有自我更新能力、分化潛能、免疫原性低、致瘤性低以及其他生物學(xué)特性的新型成體干細(xì)胞[37]。EnSCs是從月經(jīng)血及子宮內(nèi)膜組織培養(yǎng)中獲取的由間充質(zhì)干細(xì)胞、側(cè)群干細(xì)胞以及上皮細(xì)胞組成的細(xì)胞群，易于提取及培養(yǎng)，因此這些細(xì)胞也稱為經(jīng)血衍生的干細(xì)胞[38]。

EnSCs被確認(rèn)為標(biāo)志保留細(xì)胞，可能通過間充質(zhì)細(xì)胞到上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，顯示出在子宮內(nèi)膜修復(fù)和再生中的作用。EnSCs與BMSCs相似且具有更大優(yōu)勢：①EnSCs可以很容易且無創(chuàng)地獲得；②EnSCs具有廣泛擴(kuò)增和快速擴(kuò)增的特性；③MMP表達(dá)量較高[39]。目前，實(shí)驗(yàn)和臨床均顯示，EnSCs在治療薄型子宮內(nèi)膜和Asherman綜合征方面有再生和修復(fù)的作用，其作用機(jī)制可能為通過促進(jìn)波形蛋白、VEGF以及細(xì)胞角蛋白的表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜病變的修復(fù)，從而重建子宮內(nèi)膜[40-41]。

EnSCs用于治療薄型子宮內(nèi)膜、宮腔粘連等導(dǎo)致的胚胎著床率和子宮內(nèi)膜容受率低等引起的不孕已取得良好效果。然而，目前尚無研究發(fā)現(xiàn)EnSCs存在特異性細(xì)胞表面分子，使細(xì)胞分離純化面臨困難，且EnSCs移植后存在宮腔外異位種植，增加了子宮內(nèi)膜異位癥風(fēng)險(xiǎn)，其有效性和安全性還有待進(jìn)一步證實(shí)[31,42]。

3.3ESCs ESCs通常源自植入前胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是具有多譜系分化潛能并具有無限增殖能力的永生干細(xì)胞。在確定的培養(yǎng)條件下，ESCs可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、視錐細(xì)胞、心肌細(xì)胞、起搏細(xì)胞以及卵子和精子等，可用于組織再生和以組織特異性方式治療疾病，由于巨大的發(fā)展能力和無限的自我更新能力，ESCs具有多樣化的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[43-44]。

研究發(fā)現(xiàn)，ESCs通過與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)和胚狀體誘導(dǎo)，具有分化為子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞的潛能；此外，該研究還檢測到了與子宮內(nèi)膜細(xì)胞功能相關(guān)的因子，即雌激素受體和孕激素受體[45]。另有研究證明，ESCs與膠原支架結(jié)合治療薄型子宮內(nèi)膜可促進(jìn)損傷處子宮內(nèi)膜腺體和子宮內(nèi)膜組織生成，并提高大鼠妊娠率，ESCs與膠原支架結(jié)合可以顯著支持全層損傷的大鼠模型中子宮的功能恢復(fù)和修復(fù)[46]。

由于ESCs自身一些生長因子的分泌，使誘導(dǎo)分化的效果受到影響，以致不能大量生成特定細(xì)胞，而需要進(jìn)行細(xì)胞篩選，且純度不高，故其有效性需進(jìn)一步探討。同時(shí)，ESCs具有形成畸胎瘤的潛力，因此其臨床應(yīng)用受到極大限制。

3.4iPSCs iPSCs可以定義為“胚胎干細(xì)胞樣”細(xì)胞，其源自成體細(xì)胞的重編程，引入特定的多能相關(guān)基因。iPSCs可以在培養(yǎng)中廣泛繁殖，并可以產(chǎn)生3個(gè)生殖細(xì)胞層，即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層[47]。iPSCs具有分化為人體所有類型細(xì)胞和無限增殖的能力，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的潛力[48]。

患Asherman綜合征的女性成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的iPSCs可以提供產(chǎn)生子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的途徑，而子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞可以移植到子宮腔中以重建子宮內(nèi)膜[49]。由于iPSCs分化的早期囊胚具有與ESCs類似的特定特征，因此iPSCs可能是ESCs的無限來源。ECSs和iPSCs可以建立人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞和合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞，用于治療與先兆子癇相似的疾病[50]。

從理論上講，iPSCs技術(shù)避免了ESCs的局限性，包括相關(guān)的倫理和法律問題以及同種異體移植的免疫排斥[51]。但隨著二代高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，iPSCs基因組的不穩(wěn)定性被報(bào)道，且可以在iPSCs產(chǎn)生的任何階段發(fā)生[52]。iPSCs的臨床應(yīng)用由于遺傳變異的存在容易使宿主產(chǎn)生自發(fā)性腫瘤，引起了嚴(yán)重的安全問題，阻礙了基于iPSCs的新療法的進(jìn)步[53]。

3.5UC-MSCs 臍帶通常在分娩時(shí)被拋出，以非侵入性方式獲得，具有較ESCs更少的倫理限制，是干細(xì)胞最主要的來源。臍帶是HSCs和間充質(zhì)干細(xì)胞的豐富來源，易于大規(guī)模培養(yǎng)，且再生潛力強(qiáng)大[54]。

UC-MSCs移植治療薄型子宮內(nèi)膜可顯著改善子宮內(nèi)膜形態(tài)和提高胚胎著床率，減少纖維化及其標(biāo)志物，并能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，同時(shí)上調(diào)子宮內(nèi)膜基質(zhì)、上皮和血管標(biāo)志物的表達(dá)，證明UC-MSCs移植可能通過抑制過度纖維化和炎癥，增強(qiáng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)再生，修復(fù)受損的子宮內(nèi)膜并恢復(fù)其生育能力[55]。已有研究制備載有UC-MSCs的膠原支架并用于子宮內(nèi)膜再生，膠原支架/UC-MSCs移植可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和上皮細(xì)胞恢復(fù)，并維持子宮內(nèi)膜損傷模型正常的腔結(jié)構(gòu)，其機(jī)制可能為通過增強(qiáng)雌激素受體α和孕激素受體的表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生和膠原重塑，并改善再生子宮內(nèi)膜接受胚胎的能力，促進(jìn)子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)[56]。然而，UC-MSCs存在合法性、安全性和有效性方面的倫理問題。

4 小 結(jié)

干細(xì)胞對薄型子宮內(nèi)膜的再生和修復(fù)起到關(guān)鍵作用，為難治性薄型子宮內(nèi)膜提供了一種新的潛在治療方法和思路。然而，干細(xì)胞治療薄型子宮內(nèi)膜也面臨不少難題。首先，干細(xì)胞治療薄型子宮內(nèi)膜的研究仍處于探索階段，干細(xì)胞的有效性、穩(wěn)定性、安全性及作用機(jī)制亟須進(jìn)一步研究證實(shí)；其次，干細(xì)胞治療薄型子宮內(nèi)膜需要尋找細(xì)胞性狀穩(wěn)定且對患者造成創(chuàng)傷較小的干細(xì)胞載體，并兼顧降低干細(xì)胞載體獲取的難度以及減輕提供者痛苦等問題。雖然目前研究面臨困難，但干細(xì)胞強(qiáng)大的修復(fù)和再生能力卻有望在不久的將來成為較藥物治療和手術(shù)治療更加有效的治療新途徑。