甲狀腺乳頭狀癌自噬相關(guān)蛋白LC3與Beclin1及其調(diào)控基因的表達(dá)與分析*

陳興 鄭俊杰 張愛龍 游振輝

迄今為止，甲狀腺癌仍是目前臨床發(fā)病率最高的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤之一，約占總?cè)丝诘?%[1]，且有逐年增長(zhǎng)之趨勢(shì)[2]，其增速之快應(yīng)得到臨床工作者的足夠重視。甲狀腺癌表現(xiàn)為幾種常見的亞型，包括甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、濾泡癌（follicular carcinoma，F(xiàn)C）、髓樣癌（medullary carcinoma，MC）、低分化癌（poorly differentiated carcinoma，PDC）和間變性癌（anaplastic carcinoma，AC），且臨床表現(xiàn)與預(yù)后各不相同，其中，PTC 亞型最為常見，占比可達(dá)85%～90%[3]。盡管PTC惡性度較低、發(fā)展緩慢、預(yù)后較好，但是仍有10%左右的患者在治療后期出現(xiàn)復(fù)發(fā)、侵襲的情況，且大概率發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率可達(dá)15%～50%；此外，淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移甚至高達(dá)70%～80%，極大程度影響了患者的無病生存期和死亡率[3-4]。因此，深入了解PTC 病因及發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要。近年來，依托越來越完善的分子生物學(xué)技術(shù)，更多學(xué)者將組織病理結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到PTC 研究領(lǐng)域。在腫瘤研究領(lǐng)域，自噬被認(rèn)為是細(xì)胞溶酶體的降解，其在PTC 發(fā)生過程中的角色受到廣泛關(guān)注。目前認(rèn)為自噬在腫瘤發(fā)生的起始階段，自噬可抑制腫瘤發(fā)生，但隨著體內(nèi)腫瘤的發(fā)展，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演者雙重調(diào)節(jié)的作用[5]。

Beclin1 是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬現(xiàn)象的關(guān)鍵蛋白，同時(shí)也是細(xì)胞啟動(dòng)自噬的標(biāo)志[6]。人類微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）是編碼自噬相關(guān)蛋白的關(guān)鍵基因，參與了哺乳動(dòng)物自噬形成中的泛素樣蛋白加工修飾過程，在細(xì)胞內(nèi)以LC3-I 及LC3-Ⅱ兩種形式存在，并可通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的LC3 及其向LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化以判斷細(xì)胞自噬是被誘導(dǎo)還是被抑制[7-9]?，F(xiàn)已知在人類LC3 蛋白有3 種亞型（LC3A、LC3B和LC3C），韓國(guó)學(xué)者Kim 等[1]研究表明，LC3 的兩個(gè)亞型LC3A 和LC3B 在不同病理類型的甲狀腺癌中的表達(dá)有所差異。鑒于此，為明確自噬相關(guān)蛋白LC3 與Beclin1 及其調(diào)控基因LC3A、LC3-B 和BECN1 在PTC 患者中發(fā)揮的作用及對(duì)患者預(yù)后的影響，本研究對(duì)20 例PTC 患者術(shù)后新鮮組織標(biāo)本和20 例甲狀腺良性病變切除的正常甲狀腺新鮮組織標(biāo)本進(jìn)行了LC3 與Beclin1 及其調(diào)控基因表達(dá)情況的研究分析，探討細(xì)胞自噬在甲狀腺乳頭狀癌形成中的作用，旨在為PTC 患者的早期診斷提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析本院2018年12月-2019年12 月確診并行手術(shù)切除的PTC 患者20 例，同期因甲狀腺良性病變就診的患者20 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：入組患者均為初診患者；患者臨床資料完整，術(shù)前未進(jìn)行放療、化療、同位素治療及內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：收住院期間詢問病史，術(shù)前合并其他腫瘤；二次或以上手術(shù)及復(fù)發(fā)；術(shù)后診斷為PTC 合并甲狀腺其他類亞型癌。入組患者（PTC 組和良性病變組）術(shù)中留取兩塊黃豆粒大小的新鮮組織，分別用于RT-PCR 檢測(cè)和Western Blot 檢測(cè)。所有用于科學(xué)研究的標(biāo)本均置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)過福建省立醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，入組患者已被告知本研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 分別取前期保存的PTC 組織和良性病變甲狀腺組織各50 mg，加入1 mLTrizol 試劑冰上研磨，待測(cè)組織總RNA 的提取參照試劑盒說明書進(jìn)行。抽提結(jié)束后，核酸濃度測(cè)定儀（260 nm）測(cè)定總RNA 濃度與純度，OD260/OD280=1.8～2.0，以確保RNA 達(dá)到可靠純度，同時(shí)電泳檢測(cè)RNA 的完整度。分別參考cDNA 第一鏈合成試劑盒（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）說明書及KAPA?SYBR?rapid quantitative PCR Kit 試劑盒操作步驟開展檢測(cè)。擴(kuò)增體系：包括2 μL cDNA，0.5 U/mL TaqDNA 聚合酶，0.2 mmol/L dNTP，2.5 μL 10×PCR Buffer（含0.5 mol/L KCl，0.1 mol/L Tris-HCl pH 值8.3），1.5 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L 目的基因引物，最后加ddH2O 至25.0 μL。反應(yīng)體系：94 ℃ 5 min-94 ℃ 30 s-55 ℃ 30 s-72 ℃60 s，35 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。目的基因及內(nèi)參基因正、反向引物序列見表1，采用BIO-RAD Connect 熒光定量PCR 儀器進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 目的基因及內(nèi)參基因正、反向引物序列

1.2.2 Western Blot 檢測(cè) 分別取前期保存的PTC組織和良性病變甲狀腺組織各約100 mg，用配制好的RIPA 裂解緩沖液制備蛋白裂解物，加入5 倍體積的裂解液于冰上充分研磨4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清液重復(fù)上述步驟，再次離心取上清液，上清液經(jīng)蛋白定量后，取60 μg 蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）上，浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中，搖床上室溫封閉2 h，一抗1∶1 000 孵育4 ℃過夜，用TTBS 充分洗膜后，加入二抗1∶4 000 室溫孵育1 h，TTBS 清洗顯色液顯色后，用掃描儀進(jìn)行灰度掃描，照相經(jīng)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 PTC 組中男6 例，女14 例，平均年齡（42.3±5.2）歲；良性病變組中男5 例，女15 例，平均年齡（41.3±5.3）歲。兩組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 RT-PCR 結(jié)果 RNA 抽提結(jié)束后，核酸濃度測(cè)定儀（260 nm）測(cè)定總RNA 濃度與純度均符合實(shí)驗(yàn)要求，同時(shí)凝膠電泳顯示較好的RNA 完整性，見圖1A。RT-PCR 結(jié)果顯示，與良性病變甲狀腺組相比，PTC 組LC3B 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)（9.44±1.75）較良性組（2.09±0.37）顯著上 升（P=0.026 8），LC3A 基 因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（1.39±0.24）較良性組（1.32±0.46）略上調(diào)（P=0.792），BECN1 基 因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（1.20±0.25）較良性組（1.29±0.52）稍有降低（P=0.750）。見圖1B。

圖1 RT-PCR結(jié)果

2.3 兩組Beclin1 蛋白表達(dá)情況比較 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，惡性組Beclin1 蛋白表達(dá)（2.27±0.35）與良性組（1.96±0.16）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.059 5）。見圖2。

2.4 兩組中LC3A 和LC3B 蛋白表達(dá)情況比較 Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，惡性組LC3A 蛋白表達(dá)情況（0.76±0.02）與良性組（0.74±0.02）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0604），LC3B 蛋白表達(dá)顯著性增強(qiáng)（0.79±0.16） vs （0.25±0.01）（P=0.000），LC3B/LC3A 比值顯著升高（1.04±0.02）vs （0.33±0.01）（P=0.000）。見圖3。

圖2 Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖3 LC3A和LC3B蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

PTC 是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，可于任何年齡階段發(fā)病，甚至在某些地區(qū)已成為發(fā)病率最高的惡性腫瘤[10]，但其惡性程度低，加上全民健康意識(shí)的提升，PTC 患者的10 生存率能高達(dá)90%以上[11]。然而，PTC 較高的侵襲性卻也導(dǎo)致患者病死率逐年增加。因此，需要在PTC 發(fā)生初期進(jìn)行特異性高的早期篩查和針對(duì)性治療，確保在PTC 發(fā)生后患者均能得到有效治療和預(yù)防復(fù)發(fā)舉措，而尋找到PTC 相關(guān)的特異性分子標(biāo)記物可有效地解決這一問題，為PTC 的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

細(xì)胞自噬是一種高度保守的生物行為，它可以對(duì)體內(nèi)的大分子物質(zhì)及細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)通過溶酶體途徑進(jìn)行降解，是維持細(xì)胞平衡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及基因穩(wěn)定性必不可少的代謝過程[12-14]。細(xì)胞自噬作為3 種細(xì)胞程序性死亡方式之一，在形態(tài)學(xué)表型上具有一定的特點(diǎn)：自噬發(fā)生過程中，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的自噬泡，其內(nèi)包裹著胞質(zhì)成分和細(xì)胞器，并與溶酶體融合后再降解。有研究表明，在自噬相關(guān)基因LC3 和BECN1 的調(diào)控下，人體內(nèi)環(huán)境可利用自噬強(qiáng)弱影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[15-18]。Beclin1 基因是酵母自噬基因Atg6 的同源類似物，是第一個(gè)被鑒定的自噬基因，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，Beclin1 基因通過調(diào)節(jié)自噬強(qiáng)弱進(jìn)而對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。LC3-Ⅱ作為自噬活動(dòng)的特異性標(biāo)志物，參與自噬的延伸并促進(jìn)自噬體的形成，其表達(dá)水平的高低反映了自噬水平的高低[19]。在乳腺癌、大腸癌、肺癌、卵巢腫瘤、胰腺癌等多種惡性腫瘤中均存在自噬活性失?，F(xiàn)象[20-25]。同時(shí)，自噬在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起雙重作用，在不同器官腫瘤或同一器官不同類別腫瘤，甚至同一腫瘤的不同發(fā)展階段中的表達(dá)情況可能都會(huì)呈現(xiàn)出一定的差異性。陳小林等[15]研究表明，Beclin1 和LC3 在甲狀腺癌組織中呈低表達(dá)，導(dǎo)致表達(dá)降低的組織細(xì)胞的自噬能力降低，細(xì)胞生長(zhǎng)周期增加，從而間接造成了胞增值能力和轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)，為腫瘤的形成提供有利條件。然而，孫芳紅等[12]研究顯示，在大多數(shù)癌旁的甲狀腺組織細(xì)胞中LC3 呈低水平表達(dá)，而在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。而在本研究中，相比于良性病變甲狀腺組織，惡性PTC 組織中Beclin1 蛋白上調(diào)表達(dá)，提示PTC 組織中細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，但未達(dá)到顯著性差異（P＞0.05）。考慮到LC3 蛋白受LC3A和LC3B 兩個(gè)基因的雙重調(diào)節(jié)，目前研究顯示LC3B基因顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.05），LC3A 基因略微上調(diào)表達(dá)（P＞0.05），為此，本課題組分別研究LC3A 和LC3B 在PTC 和良性病變甲狀腺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PTC 組和良性組LC3A 蛋白表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05），而LC3B 蛋白表達(dá)具有顯著性差異，LC3B/LC3A 比值亦顯著升高（P＜0.05），提示PTC組織中細(xì)胞自噬活性顯著增強(qiáng)。目前與PTC 相關(guān)的LC3A 和LC3B 的研究相對(duì)較少，在開展PTC發(fā)生、發(fā)展與自噬蛋白相關(guān)性研究時(shí)，應(yīng)綜合考慮LC3 及其亞型蛋白LC3A 和LC3B 在腫瘤組織中表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

綜上所述，LC3B 亞型蛋白可能是PTC 患者的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，在后期研究中應(yīng)考慮大樣本驗(yàn)證，以明確LC3B 蛋白作為判斷甲狀腺良惡性腫瘤的生物標(biāo)記物的可行性；同時(shí)，應(yīng)結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)，綜合判斷LC3A、LC3B 蛋白強(qiáng)度以及LC3B/LC3A 比值與其他臨床病理參數(shù)的關(guān)系。