參苓白術顆粒對膿毒癥大鼠的保護作用及對肺水代謝的影響*

巫莉萍 薛小燕 溫建東

膿毒癥是感染、創(chuàng)傷等誘發(fā)劇烈全身性炎癥反應，引起組織器官繼發(fā)性損傷的臨床癥候群，膿毒癥休克是重癥監(jiān)護患者最常見的死亡原因，死亡率高達20%～80%[1]。肺是膿毒癥最易受影響的靶器官，肺損傷往往最早出現(xiàn)，一旦出現(xiàn)肺損傷往往預示預后不佳[2]。急性肺損傷是各種直接或間接因素引起肺泡上皮細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫、急性低氧性呼吸功能不全等[3]。臨床證實，肺水清除率高的膿毒癥患者，需要呼吸機支持治療的時間相對縮短，病死率降低[4]。本研究主要探討具有補益脾肺之氣和利水滲濕作用的參苓白術顆粒對膿毒癥大鼠的保護作用以及對肺水代謝的影響，證實免疫增強對膿毒癥治療有效，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 膿毒癥大鼠模型 該研究起止時間為2017 年1 月-2019 年4 月，選擇6～8 周齡健康雄性SD 大鼠40 只，體質量200～230 g，由贛南醫(yī)學院實驗動物中心提供，經(jīng)普通飼料適應性喂養(yǎng)1 周后備用。將40 只大鼠隨機分為對照組、模型組、參苓白術預防組和治療組，每組10 只，參苓白術顆粒購自云南騰沖制藥廠。

1.2 方法 對照組手術切開后在縫合，模型組構建膿毒癥模型，預防組在造模前即應用參苓白術灌胃處理，治療組在造模后才應用參苓白術灌胃處理。采用盲腸結扎穿刺法（CLP）復制膿毒癥模型：術前禁食12 h，烏拉坦（1 250 mg/kg）腹腔注射麻醉，將大鼠仰面固定，中下腹取4 cm×4 cm 面積備皮，常規(guī)消毒，沿腹正中線做3 cm 長切口，沿腹白線分離肌層切開腹膜進入腹腔，游離腸系膜和盲腸，以手術絲線環(huán)形結扎盲腸根部，用21 號針頭在結扎端貫通穿刺1 次，擠出糞便少許，還納腸段，依次縫合腹膜和皮膚，消毒手術創(chuàng)面。

1.3 觀察指標和檢測方法

1.3.1 肺組織病理觀察 （1）大體觀察：麻醉后剪開胸腔完整取出雙側肺葉，濾紙吸干表面血跡，肉眼觀察肺臟的形態(tài)變化。（2）病理學HE 染色及評分：取左肺放于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯浸透、石蠟包埋、5 μm 厚切片、二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水、HE 常規(guī)染色、封片后光鏡觀察肺組織病理變化。每一標本由同一位病理醫(yī)生根據(jù)肺間質水腫、肺泡水腫、炎細胞浸潤、肺泡出血、透明膜形成和肺不張改變共6 個項目，按無、輕、中、重分別計0、1、2 和3 分，各項相加總分0～18 分，分值越高，肺損傷越重。（3）肺濕重/干重比值（W/D）測定：開胸后取右肺上葉，生理鹽水漂洗，濾紙吸干表面液體稱濕重，經(jīng)70 ℃烘箱烘烤48 h 后稱干重，計算W/D，剩余標本置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肺組織AQP-1 mRNA 含量檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈（qRT-PCR）法檢測，結扎右主支氣管，剪右中肺組織，立即置于液氮罐中-180 ℃保存，組織研磨后用Trizol 抽提組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計、瓊脂糖電泳檢測RNA 純度和完整性。按照逆轉錄試劑盒（takara，Code NO.RR036A）說明書合成cDNA。參照SYBRPremix Ex TaqTM 試劑盒說明書建立20 μL 反應體系，其中2μL cDNA為模板擴增，肌動蛋白β-actin 為內(nèi)參照，利用PCR 儀擴增。反應條件為：95 ℃ 30 s 變性，95 ℃5 s，60 ℃ 31 s，40 個循環(huán)。樣品管和內(nèi)參管均設3 個復管，反應結束后，ABI7300 SDS Software 自動分析熒光信號轉換CT 值，CT 值取3 個復管的平均值?！鰿T 為目的基因CT 值與內(nèi)參CT 值的差值，以2-△△CT法計算目的基因與內(nèi)參基因熒光的比值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用方差齊性分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織大體觀察水腫和出血嚴重，半定量評分升高，W/D 值增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，預防組和治療組評分降低，W/D 值下降，并且預防組比治療組評分降低，W/D 值下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺組織病理比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織病理比較（±s）

*與對照組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；△與治療組比較，P＜0.05。

2.2 各組大鼠肺組織AQP-1 mRNA 表達比較 對照組、模型組、預防組和治療組AQP-1 mRNA 表達分別為（0.36±0.09）、（0.75±0.19）、（0.42±0.11）、（0.56±0.14），與對照組比較，模型組大鼠肺組織AQP-1 mRNA 表達增加（t=32.236，P＜0.001）；與模型組比較，預防組和治療組AQP-1 mRNA 表達均減少（t=-26.532、-15.234，P＜0.001）；并且預防組比治療組AQP-1 mRNA 表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（t=-13.236，P＜0.001）。見圖1。

圖1 qRT-PCR法檢測肺組織AQP-1 mRNA表達

3 討論

大量研究證明，單一對膿毒癥進行抗炎而忽視免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是不夠的[5]。與非膿毒癥死亡患者相比，膿毒癥死亡患者存在明顯的免疫抑制表現(xiàn)，免疫強化治療可改善臨床療效[6]。膿毒癥的病程進展迅速，早期非常短，一般不易發(fā)現(xiàn)，入院時多處于中晚期，此時機體經(jīng)歷臟氣受損、正邪相爭的階段，很快進入臟氣衰敗階段。這一轉變過程相當于西醫(yī)提出的膿毒癥誘因到膿毒癥、全身炎癥反應綜合征（SIRS）到多器官功能障礙綜合征（MODS）[7]。幾乎所有膿毒癥患者均可見正氣不足之征，疾病越重氣虛越明顯，甚至形成陽氣虧損、陰竭陽脫等危急癥候。

從《內(nèi)經(jīng)》陰陽的關系來看，嚴重膿毒癥開始以應激反應和炎癥反應作為機體的保護機制，類似中醫(yī)所說的正氣奮起抗邪，屬于實證。但應激反應和炎癥反應過度則引起機體應激和免疫失衡，類似中醫(yī)的陽勝則陰衰，從而出現(xiàn)急性陰陽失衡的狀態(tài)，嚴重膿毒癥在進展過程中常出現(xiàn)免疫麻痹，類似中醫(yī)正氣無力抗邪的急性虛證，表現(xiàn)“邪毒熾盛，正氣已虛”之本虛標實的病機特點[8]。所以，中醫(yī)認為膿毒癥發(fā)病多由邪毒入侵（嚴重感染）損傷正氣，故正虛邪盛貫穿于膿毒癥發(fā)病的全過程[9]。

現(xiàn)代醫(yī)學在邪盛方面的治療具有明顯優(yōu)勢，例如廣譜抗菌藥物、外科手術、呼吸機、床邊連續(xù)性腎臟替代治療（CRRT）等，是中醫(yī)始終難以超越的[10]。現(xiàn)代醫(yī)學在增強機體自身抵抗力方面非常有限，效果欠佳；而中醫(yī)在扶正方面可謂得心應手，在正虛方面大有作為。扶正包括陽（氣）、陰（血）兩個方面，中醫(yī)認為“有形之血不可速生，無形之氣所當速固”?，F(xiàn)代醫(yī)學通過大量補液、輸血、輸人蛋白而使血（陰）受損迅速得到糾正，但氣（陽）受損難以用現(xiàn)代手段短時間內(nèi)恢復[11]。中醫(yī)《內(nèi)經(jīng)》認為正氣內(nèi)虛是所有疾病的根本原因，也是膿毒癥發(fā)病的根本原因[12]?！秲?nèi)經(jīng)》云：“陰平陽秘，精神乃治，陰陽離決，精氣乃絕?！闭f明機體正氣充足，陰陽調(diào)和，則疾病痊愈，可恢復健康；若陰陽受損進而離絕，則生命消逝。所以扶助陽氣就成為中醫(yī)治療膿毒癥的重點，也是中西醫(yī)結合治療膿毒癥的切入點[13]。

既往中醫(yī)治療膿毒癥多從毒瘀入手，近年來，扶正逐漸成為膿毒癥治療的熱點。益氣扶正，可以補氣通陽，使陽氣暢達，通過整體調(diào)節(jié)，發(fā)揮機體本身的抗病能力，促進內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，達到“各安其氣，必清必靜，則病氣衰去，歸其所宗”[14]。因此，中醫(yī)強調(diào)補氣在膿毒癥治療中的重要作用是基于中西醫(yī)結合取兩者之長，在現(xiàn)代西醫(yī)急救手段的配合下，發(fā)揮中醫(yī)的優(yōu)點，整體調(diào)節(jié)，提高機體本身的抗病能力，促進內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，爭取達到最佳療效，提高治愈率，降低病死率[15]。

通過該研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠肺組織大體觀察水腫和出血嚴重，半定量評分升高，W/D 值增加，AQP-1 mRNA 表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，預防組和治療組評分降低，W/D 值下降，AQP-1 mRNA 表達減少，并且預防組比治療組評分降低，W/D 值下降，AQP-1 mRNA 表達減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。參苓白術散藥性味平和，由人參、茯苓、白術、山藥、白扁豆、蓮子、薏苡仁、砂仁、桔梗、炙甘草組成，具有健脾益氣，利水滲濕之功效[16]。研究發(fā)現(xiàn)，對非酒精性脂肪性肝病的防治療效顯著；對免疫功能的調(diào)節(jié)作用，如脾虛泄瀉小鼠模型和環(huán)磷酰胺誘導小鼠免疫抑制動物模型，能顯著增強其免疫功能；增加或減少腸道細菌數(shù)量，恢復腸道菌群平衡，保護腸道黏膜組織，雙向改善胃腸動力，治療胃動力不足或腹瀉[17-18]。中醫(yī)理論認為，肺主通調(diào)水道，屬“金”，脾主運化水濕，屬“土”，脾肺互為母子關系，通過培土生金既可補益脾肺之氣達到免疫強化之功，又能促進水液的正常代謝。參苓白術顆粒具有健脾益氣之效、桔?？梢幧闲?，取培土生金之意增強免疫力；茯苓、薏苡仁、砂仁兼有化濕利水之效，可促進肺水代謝[19]。

綜上所述，參苓白術顆粒能夠降低膿毒癥肺損傷嚴重程度，抑制肺組織AQP-1 表達，改善肺水代謝，并且預防性應用較治療效果更突出。該研究創(chuàng)新之處為目前還未見有參苓白術顆粒在膿毒癥中的應用報道，更未見從肺水代謝方面研究其保護機制，通過該研究既能證實“免疫強化對膿毒血癥有效”這一理論，為拓展膿毒癥的藥物治療提供實驗依據(jù)，為患者帶來更佳的治療效果，又能進一步闡明參苓白術顆粒對膿毒癥的保護機制是否與影響肺水代謝有關。