逍遙丸對產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知的影響機制*

劉雁 張錦 趙晨翔 王坤峰 趙天辰 侯祥林 季粟英

產(chǎn)前應(yīng)激（prenatal stress，PS）是指孕期婦女受到內(nèi)外環(huán)境變化及精神心理因素等刺激產(chǎn)生的全身、非特異性的應(yīng)激反應(yīng)。多項研究表明，在懷孕期間，如果母親出現(xiàn)應(yīng)激等不良的情緒變化，導(dǎo)致子代更容易出現(xiàn)情感、行為和認(rèn)知等方面能力的下降[1-2]。2001 年有研究指出在孕期這一特殊敏感時期，宮內(nèi)環(huán)境的改變會影響胎兒的發(fā)育，如會導(dǎo)致胎兒顱骨畸形，心肌結(jié)構(gòu)受損等，并且會對胎兒的生理系統(tǒng)產(chǎn)生長遠(yuǎn)影響[3-4]。Carmichael 等[5]報道產(chǎn)前社會心理性應(yīng)激因素可增強先天畸形兒的發(fā)病率，如患神經(jīng)管畸形率增加接近2 倍。流行病學(xué)調(diào)查也顯示產(chǎn)前應(yīng)激可明顯影響新生兒出生時的頭圍和體重，尤其以頭圍減小最為明顯，證實了PS 可對胎兒的腦發(fā)育產(chǎn)生特異性影響[6]。伴隨PS 對子代影響的深入研究，發(fā)現(xiàn)PS 不僅影響胎兒的身體發(fā)育情況，如頭圍、體重、各器官的畸形等，而且會影響子代的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力和情緒障礙[7]。產(chǎn)前應(yīng)激導(dǎo)致子代認(rèn)知功能障礙的研究，一般認(rèn)為與海馬突觸可塑性與長時程增強（long-term potentiation，LTP）和長時程壓抑（long-term depression，LTD）有關(guān)[8]。而谷氨酸受體中的AMPARs 在調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9-10]。

AMPARs 由四個亞基構(gòu)成，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如海馬體、腦皮層，杏仁核和丘腦[11]。AMPARs 主要與離子通道偶聯(lián)，形成受體通道復(fù)合物，介導(dǎo)快信號傳遞。前期大量研究已經(jīng)證實海馬體CA1 區(qū)的AMPARs 誘導(dǎo)了LTP 和LTD 的產(chǎn)生[12-15]。AMPARs 調(diào)節(jié)LTP 和LTD 的作用尤其在生物發(fā)育早期發(fā)揮關(guān)鍵作用。Bradley 等[16]研究發(fā)現(xiàn)空間學(xué)習(xí)能力的小鼠海馬體中的AMPA 受體數(shù)量與正常相比明顯減少，Penn 等[17]也發(fā)現(xiàn)AMPA 受體在壓力誘導(dǎo)的受損的空間學(xué)習(xí)和記憶等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

逍遙丸出自宋代《太平惠民和劑局方》，因其具有疏肝解郁、健脾養(yǎng)血的功效，以前常作為中醫(yī)調(diào)理情志病的藥方，并有研究發(fā)現(xiàn)逍遙丸具有抗抑郁的作用[18]。然而，逍遙丸是否具有改善認(rèn)知的作用，目前還沒有報道，本文將就此開展研究，探討逍遙丸是否可以改善PS 子代的學(xué)習(xí)記憶能力以及具體影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2018 年9 月-2019 年11 月進行，所有40 只SD 大鼠購自濟南金豐實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（魯）2018-0006。均飼養(yǎng)在溫度24 ℃、濕度60%、12 h∶12 h（8：00-20：00）光-暗循環(huán)的動物房中，自由飲水飲食。飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境后，將雌性大鼠（230～250 g）和雄性大鼠（280～350 g），按照3∶1 比例于20∶30進行合籠，次日8：30 前對雌性大鼠陰道進行涂片檢查。若精子陽性定為妊娠第0 天，然后將受孕大鼠單籠飼養(yǎng)，

1.2 實驗方法

1.2.1 造模 按照文獻(xiàn)[19-20]方法將孕鼠置于一個透明兩端均有通風(fēng)口的塑料圓柱形裝置里，內(nèi)部直徑約6 cm。其一端通風(fēng)口底部固定，另一端則根據(jù)孕鼠體長適當(dāng)調(diào)整長度。束縛應(yīng)激3 次/d 進行，即在其孕14～20 d 的8：00-11：00、12：00-15：00、16：00-19：00 三個時間段各進行1 次，45 min/次。為防止應(yīng)激大鼠產(chǎn)生習(xí)慣性，每次應(yīng)激的間隔時間均不少于2 h。在子鼠出生21 d 斷奶后，每窩隨機拿出子代大鼠1～2 只進行后續(xù)實驗。所有子鼠均單籠飼養(yǎng)在溫度24 ℃、濕度60%、12 h∶12 h（8：00-20：00）光-暗循環(huán)的動物房中。

1.2.2 給藥及分組 出生后第21 天子代大鼠，未進行產(chǎn)前應(yīng)激為正常組（CON）；產(chǎn)前應(yīng)激子代逍遙丸（生產(chǎn)廠家：仲景宛西制藥股份有限公司，批注文號：國藥準(zhǔn)字Z41021831，規(guī)格：每8 丸相當(dāng)于原藥材3 g），200 mg/kg 溶于0.9%氯化鈉溶液及相應(yīng)0.9%氯化鈉溶液灌胃，作為PS+Xiaoyao Pill 組和PS+NS 組。逍遙丸溶液灌胃10 mL/kg，連續(xù)進行30 d，PS+NS 組灌胃對等的0.9%氯化鈉溶液。未行灌胃的產(chǎn)前應(yīng)激子代為PS 組。每組均為10 只。

1.2.3 Morris 水迷宮實驗 受試子代大鼠訓(xùn)練前1 d 首先放到水迷宮（直徑180 cm，水溫22 ℃）中適應(yīng)1 min。訓(xùn)練時間6～7 d，2 次/d。訓(xùn)練過程中，大鼠進入水迷宮游泳5 min，到達(dá)平臺后（平臺在水面下1.5 cm），記憶鞏固30 s。訓(xùn)練結(jié)束后，撤去平臺，記錄大鼠首次到達(dá)平臺的時間，以及運行軌跡和運動速度。數(shù)據(jù)由SMART 3.0（Panlab，Spain）軟件進行記錄。

1.2.4 West blot 實驗 行為學(xué)完成后，麻醉后冰上快速分離出海馬組織。稱重后放入預(yù)冷的RIPA裂解液（Solarbio，China，使用前加入蛋白酶抑制劑PMSF，使PMSF 最終濃度為1 mM）制備蛋白樣品。4 ℃，12 000 r/min 離心5 min 后收集上清。使用ND-1000 分光光度計測定蛋白濃度。每組蛋白樣品以10% SDS-PAGE 進行電泳分離，繼之電轉(zhuǎn)至0.45 μmPVDF 膜上（Millipore，U.S.A）。5%脫脂奶粉的PBST 室溫封閉2 h，加入一抗：GluA1（1∶3 300，ab31232，Abcam，U.S.A），4 ℃過 夜。次日PBST 洗膜3×10 min，然后PBST 稀釋的二抗（1∶8 000，Pioneer，China）室溫孵育1 h 后，PBST再洗3 次，15 min/次。ECL 化學(xué)發(fā)光（Millipore，China）后使用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Bad，U.S.A）拍照，Quantity One 軟件掃描目的蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t 檢驗，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 逍遙丸對PS 子代大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知的影響 PS組到達(dá)平臺所用時間為（33.91±16.34）s 明顯長于CON 組的（7.28±2.67）s，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而PS+Xiaoyao Pill 組到達(dá)平臺時間為（9.94±1.86）s 明顯短于PS+NS 組的（35.67±17.3）s，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A、B。四組的運動距離表現(xiàn)出相同的變化，見圖1A、C。四組游泳速度分別為CON 組（41.98±1.06）cm/s，PS 組（41.97±0.67）cm/s，PS+NS 組（41.93±1.16）cm/s，PS+Xiaoyao Pill 組（47.38±10.85）cm/s，四組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1A、D。

2.2 逍遙丸對PS 子代大鼠海馬體GluA1 蛋白表達(dá)的影響 PS 組GluA1 蛋白的相對表達(dá)量為（0.76±0.17） 低 于CON 組 的（1.15±0.15），PS+Xiaoyao Pill 組的GluA1 蛋白相對表達(dá)量為（1.12±0.13）高于PS+NS 組的（0.70±0.16），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

3 討論

大量研究表明母體產(chǎn)前的一些不良應(yīng)激，可影響子代的生長發(fā)育的進程以及出現(xiàn)不良的神經(jīng)發(fā)育障礙，并且哺乳動物神經(jīng)發(fā)育尤其是海馬組織大都相對集中于某一特定時間段。例如孕7～14 周是人類海馬組織發(fā)育的主要時間段，而大鼠海馬組織的發(fā)育主要集中在孕晚期，并且孕晚期還是中樞髓鞘發(fā)育加速、膠質(zhì)細(xì)胞形成以及突觸形成活躍的時期[21]。因此孕晚期的應(yīng)激較易導(dǎo)致海馬組織相關(guān)功能失調(diào)，從而引起學(xué)習(xí)記憶能力下降和抑郁焦慮等情緒障礙。這也是本研究之所以在孕晚期進行產(chǎn)前束縛應(yīng)激干預(yù)的重要依據(jù)之一。

圖2 逍遙丸對子代大鼠海馬體GluA1蛋白表達(dá)的影響

水迷宮實驗是經(jīng)典檢測學(xué)習(xí)認(rèn)知等功能的實驗之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PS 子代大鼠首次到達(dá)平臺時間明顯長于CON 組（P＜0.05），初步表明PS 可能會影響子代的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能。而經(jīng)過逍遙丸干預(yù)后，PS+Xiaoyao Pill 組時間顯著縮短，基本恢復(fù)到正常組水平，提示逍遙丸具有改善PS 造成子代大鼠認(rèn)知功能受損的作用。并且發(fā)現(xiàn)四組大鼠游動距離和其到達(dá)平臺時間相對應(yīng)，四組游泳時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明PS 只是影響子代大鼠的認(rèn)知功能，對其運動功能沒有明顯影響。

PS 導(dǎo)致子代大鼠認(rèn)知障礙的機制之前也有相關(guān)研究，但是AMPA 受體是否參與其中未見報道。為證實AMPA 受體是否參與PS 造成子代認(rèn)知障礙的過程，本研究又采用Western blot 實驗觀察AMPA受體蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PS 可導(dǎo)致子代大鼠海馬體中的GluA1 受體表達(dá)降低。由于AMPA 受體是中樞重要的一種離子型受體，在介導(dǎo)突觸傳遞，突觸可塑性的形成和維持以及神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶、感知等方面發(fā)揮重要作用，AMPARs 又是通過何種機制參與其中。本研究認(rèn)為與其在神經(jīng)突觸中的功能密切相關(guān)，海馬突觸可塑性的調(diào)節(jié)已經(jīng)證實依賴于AMPARs 功能的正常。AMPARs 如果發(fā)生改變，將明顯影響海馬突觸可塑性。多項研究暗示突觸的AMPARs 不僅在數(shù)目上，而且在分子組成上的變化都將導(dǎo)致突觸可塑性變化[22-24]。突觸可塑性是學(xué)習(xí)和記憶的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，突觸可塑性的紊亂也是多種精神疾病發(fā)生的原因之一[25]。因此由結(jié)果提示，PS導(dǎo)致子代大鼠認(rèn)知障礙的機制之一是抑制了海馬體中GluA1 蛋白受體的表達(dá)，從而導(dǎo)致突觸可塑性改變所致。而給以逍遙丸干預(yù)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可明顯提高PS 子代大鼠海馬體中GluA1 蛋白受體的表達(dá)。由此推測，逍遙丸之所以可以改善PS 大鼠的認(rèn)知功能受損，可能與其可提高GluA1 表達(dá)，從而改善突觸可塑性有關(guān)。

逍遙丸作為一種傳統(tǒng)經(jīng)典中成藥，以前作用普遍認(rèn)為具有疏肝解郁，通過補肝體、助肝用、理氣養(yǎng)血、調(diào)和肝脾而起到改善肝氣不舒，胸脅脹痛，頭暈?zāi)垦?，食欲減退，月經(jīng)不調(diào)等作用[26]。近來也有研究發(fā)現(xiàn)逍遙丸還有改善抑郁等情志疾病的作用[27]。

綜上所述，本研究進一步發(fā)現(xiàn)逍遙丸其可通過提高海馬體GluA1 的表達(dá)具有改善PS 子代大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙的作用。以往研究發(fā)現(xiàn)PS 不僅可造成子代出現(xiàn)學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙，而且還可導(dǎo)致抑郁焦慮等精神功能受損。新發(fā)現(xiàn)的逍遙丸抗抑郁及改善認(rèn)知功能的作用，可能為以后改善應(yīng)激所導(dǎo)致的神經(jīng)中樞功能受損提供新的治療方案。