噻蟲啉治療繼發(fā)性泡型包蟲病的實(shí)驗(yàn)研究

劉川川, 馬 蘭, 格日力, 樊海寧

泡型包蟲病(Alveolarechinococcosis,AE)是多房棘球絳蟲的幼蟲多房棘球蚴(E.multilocularis)寄生于人體所致的一種罕見人獸共患寄生蟲病，表現(xiàn)為惡性腫瘤的生長(zhǎng)方式并可通過血液循環(huán)擴(kuò)展到肺、腦、腎等遠(yuǎn)處器官[1-2]，該疾病主要流行于北半球[3-4]。近年來，中國(guó)西北地區(qū)的發(fā)病率有所上升，尤其在青海省，其發(fā)病率已達(dá)到0.63%[5]。該病起病隱匿，且病情發(fā)展緩慢，一旦發(fā)現(xiàn)患者多處于疾病晚期并出現(xiàn)了較為明顯的并發(fā)癥狀，如腹痛、黃疸、消瘦甚至肝功能衰竭[6]。許多患者因發(fā)現(xiàn)較晚而失去了治療的機(jī)會(huì)。若患者不行相關(guān)治療，70%患者在5年內(nèi)死亡，90%患者在確診后10年內(nèi)死亡[7]。包蟲病的治療以外科手術(shù)治療為主[8]，但藥物化療作為包蟲病的輔助治療手段，術(shù)前用于縮小病灶和抑制蟲體活性，術(shù)后用于預(yù)防包蟲病的復(fù)發(fā)，僅僅抑制了寄生蟲肉芽腫的進(jìn)展但并不能治愈這種疾病，這意味著患者必須在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)接受化療，從而造成治療高成本和藥物副作用的風(fēng)險(xiǎn)。因而，尋找治療包蟲病更為有效藥物或先導(dǎo)化合物是必要的。

噻蟲啉(Thiacloprid, Thia)是由尼古丁經(jīng)過改造開發(fā)出的新煙堿類殺蟲劑，作為一種系統(tǒng)性殺蟲劑，用于保護(hù)作物免受穿透性吸食昆蟲的侵害，并用于控制貓、狗等動(dòng)物的體表寄生蟲[9-11]。噻蟲啉對(duì)哺乳動(dòng)物來說幾乎沒有風(fēng)險(xiǎn)[12]。噻蟲啉的殺蟲活性主要來源于其對(duì)昆蟲突觸后煙堿乙酰膽堿受體(nAchRs)的激動(dòng)作用，引起乙酰膽堿的累積，導(dǎo)致昆蟲的麻痹和死亡[10]。噻蟲啉對(duì)人類和哺乳動(dòng)物毒性較低，與脊椎動(dòng)物的nAchRs作用較弱，而且不容易穿透血腦屏障[10,13]，不會(huì)在動(dòng)物組織中積聚[14]。目前已鑒定出多種多房棘球絳蟲nAchRs[15]，但對(duì)其功能均未進(jìn)一步研究。鑒于噻蟲啉對(duì)有害昆蟲以及體表寄生蟲表現(xiàn)出的良好殺傷作用，本研究擬初步探討噻蟲啉是否能殺傷多房棘球絳蟲原頭節(jié)進(jìn)而開發(fā)成為抗包蟲病先導(dǎo)化合物的潛能。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和蟲體來源 SPF級(jí)Balb/c小鼠(雄性, 18～20 g)購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)基地(合格證號(hào)：No.201901649)，并飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房中。多房棘球絳蟲原頭節(jié)來源于本實(shí)驗(yàn)室在沙鼠體內(nèi)保種。

1.2主要試劑與儀器 噻蟲啉、阿苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑亞砜均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液(PS, 100×)、HE染色試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本東仁公司。光學(xué)顯微鏡為日本Olympus產(chǎn)品，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀為瑞士Tecan產(chǎn)品，全自動(dòng)生化分析儀為日本HITACHI產(chǎn)品。

1.3多房棘球蚴原頭節(jié)分離及體外培養(yǎng) 由蒙古長(zhǎng)爪沙鼠體內(nèi)分離保種的多房棘球蚴原頭節(jié)。沙鼠麻醉后于生物安全柜內(nèi)無菌取出腹腔中泡型包蟲囊腫。將包蟲囊腫置于PBS液中剪碎，通過4層無菌紗布過濾原頭節(jié)至50 mL無菌離心管。先經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾原頭節(jié)，后使用40 μm細(xì)胞篩過濾除去鈣質(zhì)小體。原頭節(jié)自然沉降后，加入含有10%滅活FBS、1%PS RPMI1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，每3～4 d PBS清洗并更換培養(yǎng)基1次。部分原頭節(jié)用于感染Balb/c小鼠構(gòu)建繼發(fā)性包蟲病感染模型。

1.4噻蟲啉對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)的體外作用 將培養(yǎng)原頭節(jié)經(jīng)PBS洗滌后，用含有10%FBS、1%PS RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸，使每毫升培養(yǎng)基中含有約200個(gè)原頭節(jié)。將約2 000個(gè)原頭節(jié)加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并加入終濃度為10、20、40、80、120 μg/mL噻蟲啉，以10 μg/mL ABZso為陽(yáng)性對(duì)照組(ABZso組)，以0.2% DMSO作為陰對(duì)照組(DMSO組)。37 ℃ 5% CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)6 d，每日用0.1%伊紅染色原頭節(jié)隨機(jī)評(píng)估100個(gè)原頭節(jié)中存活原頭節(jié)數(shù)目，用100×放大倍數(shù)的正置顯微鏡上觀察。原頭節(jié)經(jīng)0.25%戊二醛固定后用于掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)觀察。

1.5SEM和TEM觀察 電鏡觀察噻蟲啉處理后原頭節(jié)微觀結(jié)構(gòu)的改變。體外經(jīng)噻蟲啉處理第6 d原頭節(jié)，經(jīng)2.5%戊二醛在4 ℃下避光固定24 h，然后用2% OsO4后固定2 h。隨后樣品在雙蒸水中洗滌，1%醋酸鈾處理30 min。再次經(jīng)雙蒸水清洗后，在乙醇中連續(xù)梯度(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水各10 min。進(jìn)行掃描電鏡分析，將脫水后樣品浸入六甲基二硅氮烷中，在通風(fēng)櫥中風(fēng)干，樣品噴金后于掃描電子顯微鏡(Hitachi, SU8100)下觀察。進(jìn)行透射電鏡分析時(shí)，將脫水后樣品先后經(jīng)過脫水劑和環(huán)氧樹脂滲透液，在65 ℃聚合過夜。制備50 nm的超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，使用透射電鏡(JEOL, JEM-1400PLUS)進(jìn)行觀察。

1.6噻蟲啉對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)的體內(nèi)作用 分離原頭節(jié)經(jīng)無雙抗PBS沖洗8～10次后用生理鹽水重懸，計(jì)數(shù)后以2 500個(gè)原頭節(jié)懸浮于0.3 mL生理鹽水腹腔注射感染Balb/c小鼠，另以0.3 mL生理鹽水注射10只小鼠作為空白對(duì)照組。感染后3月將感染成功包蟲小鼠隨機(jī)分為3組(10只/組)：模型組，每日給予PBS/蜂蜜(1∶1)0.4 mL灌胃；ABZ組，每日給予阿苯達(dá)唑(100 mg/kg)PBS/蜂蜜(1∶1)0.4 mL灌胃；Thia組，每日給予噻蟲啉(20 mg/kg)PBS/蜂蜜(1∶1)0.4 mL灌胃。空白對(duì)照組給予PBS/蜂蜜(1∶1)每日灌胃。灌胃4 w后，仔細(xì)剖檢取出腹腔中包蟲囊腫和脾臟并稱量，脾臟指數(shù)=[脾臟重量/(小鼠體重-包蟲囊腫重量)]×10，抑囊率(%)=[(模型組小鼠囊重-實(shí)驗(yàn)組小鼠囊重)/模型組小鼠囊重]×100%；部分囊腫組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，用于組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.7噻蟲啉體外毒性評(píng)價(jià) 以LO2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞評(píng)估噻蟲啉的細(xì)胞毒性。在96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中加入180 μL細(xì)胞懸液，密度均為1×104/孔。細(xì)胞經(jīng)饑餓處理24 h后，加入終濃度為10、20、40、80、120 μg/mL噻蟲啉，并以0.2% DMSO作為空白對(duì)照。經(jīng)噻蟲啉處理48 h后，去除各孔培養(yǎng)基，每孔加入90 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀讀取在490 nm處的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.8噻蟲啉體內(nèi)毒性評(píng)價(jià) 以未感染的雄性Balb/c小鼠評(píng)價(jià)噻蟲啉毒性。Balb/c小鼠分為兩組(每組6只)：對(duì)照組和Thia組(20 mg/kg)，灌胃方式和劑量同前述。小鼠經(jīng)灌胃處理4 w，麻醉后經(jīng)眼球取血，分離血清使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝、腎功能指標(biāo)。取自小鼠的肝、腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，包埋于石蠟中，制成厚度為5 μm切片，行HE染色觀察肝、腎損傷情況。

2 結(jié) 果

2.1噻蟲啉對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)作用效果 體外評(píng)價(jià)噻蟲啉對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)的殺傷作用，結(jié)果顯示：原頭節(jié)經(jīng)0.2% DMSO作用6 d后其活性率仍然較高(92.33±2.08)%，并且其形態(tài)和活動(dòng)度未見明顯改變；不同濃度噻蟲啉作用后原頭節(jié)存活率如圖1，原頭節(jié)經(jīng)40 μg/mL及以上濃度噻蟲啉作用6 d后原頭節(jié)存活率小于35%，死亡原頭節(jié)體積明顯變小，同時(shí)出現(xiàn)體壁收縮。而藥物濃度低于20 μg/mL時(shí)，對(duì)原頭節(jié)的活性無明顯影響(圖2)。

圖1 不同濃度噻蟲啉對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)存活的影響

圖2 噻蟲啉作用6d對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)形態(tài)的影響(黑色箭頭示存活原頭節(jié)，紅色箭頭示死亡原頭節(jié))

2.2噻蟲啉對(duì)原頭節(jié)微觀結(jié)構(gòu)的影響 圖3顯示40 μg/mL噻蟲啉處理6 d后掃描電鏡和透射電鏡觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)改變結(jié)果。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，未經(jīng)藥物處理原頭節(jié)未發(fā)生超微結(jié)構(gòu)的改變，經(jīng)過噻蟲啉處理后原頭節(jié)體表微絨毛結(jié)構(gòu)破壞，體壁明顯收縮，頭鉤脫落。透射電鏡結(jié)果顯示，正常多房棘球蚴原頭節(jié)被膜層表面突出許多微絨毛，被膜下細(xì)胞有較大的細(xì)胞核和核仁，細(xì)胞和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)可辨識(shí)；40 μg/mL噻蟲啉處理后原頭節(jié)微絨毛消失，被膜下細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不可辨識(shí)。

圖3 噻蟲啉對(duì)多房棘球蚴原頭節(jié)微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.3噻蟲啉對(duì)多房棘球蚴的體內(nèi)效果 通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究噻蟲啉對(duì)多房棘球蚴效果，通過測(cè)定小鼠感染原頭節(jié)后囊腫重量來確定體內(nèi)療效。經(jīng)噻蟲啉和阿苯達(dá)唑干預(yù)后每只小鼠病灶均表現(xiàn)出多囊性生長(zhǎng)，代表性囊腫如圖4所示。未治療組囊腫表面可見豐富的血管，囊泡呈葡萄串樣生長(zhǎng)。與空白對(duì)照組相比，模型組、ABZ組、Thia組脾臟指數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.20,P<0.05)；與模型組相比，ABZ組、Thia組脾臟指數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.206、10.87，P<0.05)。包蟲囊腫濕重結(jié)果顯示，與模型組相比，Thia組囊腫重量(3.66±0.65)g和阿苯達(dá)唑組囊腫重量(5.06±1.54)g明顯低于模型組組囊腫重量(10.92±2.15)g(F=41.50,P<0.05)，Thia組囊腫重量與阿苯達(dá)唑組囊腫重量之間無差異(q=2.261,P>0.05)(表1)。

圖4 噻蟲啉治療后包蟲囊腫大體形態(tài)

表1 噻蟲啉對(duì)包蟲囊腫濕重的影響

2.4噻蟲啉對(duì)包蟲囊腫形態(tài)的影響 圖5顯示了HE染色包蟲囊腫的顯微組織結(jié)構(gòu)。各組病灶的中心均表現(xiàn)為干酪樣壞死。模型組囊壁能觀察到明顯連續(xù)的生發(fā)層、角皮層、外膜層以及存活的原頭節(jié)，并且在角皮層和外膜層之間有清晰的邊界；而經(jīng)噻蟲啉處理觀察到空泡化的層壓層，未觀察到明顯的生發(fā)層。在ABZ組仍能觀察到完整的囊壁結(jié)構(gòu)及存活的原頭節(jié)。

圖5 噻蟲啉治療后包蟲囊腫HE染色觀察

2.5噻蟲啉體內(nèi)外毒性評(píng)價(jià) 藥物副作用往往限制其臨床應(yīng)用，因此從細(xì)胞和整體水平研究了噻蟲啉的毒性。體外采用細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)初步評(píng)價(jià)噻蟲啉的細(xì)胞毒性，正常LO2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞與80 μg/mL以下噻蟲啉共孵育48 h后，細(xì)胞存活率均高于95%(圖6)。

圖6 噻蟲啉對(duì)LO2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的抑制作用

通過形態(tài)學(xué)觀察和血清肝腎功能測(cè)定評(píng)價(jià)噻蟲啉的體內(nèi)毒性。HE染色結(jié)果顯示，經(jīng)噻蟲啉灌胃處理后，小鼠的肝臟、腎臟均沒有組織損傷、細(xì)胞腫脹、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，無明顯的病理學(xué)改變(圖7)。與對(duì)照組相比，噻蟲啉處理后小鼠肝腎功能指標(biāo)無明顯變化(表2)。

表2 噻蟲啉對(duì)小鼠肝腎功能的影響

圖7 噻蟲啉對(duì)小鼠肝腎形態(tài)的影響(200×)

3 討 論

包蟲病仍然是世界性的重大公共衛(wèi)生問題之一，嚴(yán)重影響牧區(qū)人群健康，給畜牧業(yè)造成了巨大的社會(huì)問題和經(jīng)濟(jì)損失[16]。藥物治療在泡型包蟲病手術(shù)前后的作用是不可替代的。包蟲病目前藥物治療主要依靠阿苯達(dá)唑，但由于需長(zhǎng)期服用而出現(xiàn)耐藥性、明顯副作用且疾病復(fù)發(fā)率高等問題，限制了其在治療中的應(yīng)用[17-18]。由于這些原因，因而需要尋找治療包蟲病的有效藥物或先導(dǎo)化合物。本研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲啉在體外能殺傷多房棘球蚴原頭節(jié)，在繼發(fā)性小鼠感染模型中也表現(xiàn)出良好的抗多房棘球蚴作用。此外，噻蟲啉未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性和肝腎毒性。

噻蟲啉作用于原頭節(jié)后，40 μg/mL噻蟲啉即可引起多房棘球蚴原頭節(jié)死亡。噻蟲啉干預(yù)后原頭節(jié)頭鉤脫落、體表收縮，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂、生發(fā)層細(xì)胞明顯破壞，原頭節(jié)體表微絨毛脫落或消失，這與吡喹酮作用后表現(xiàn)出的變化相同[19]。噻蟲啉灌胃治療后棘球蚴囊腫重量較模型組明顯減低，但與ABZ組之間無差異，說明噻蟲啉在體內(nèi)對(duì)多房棘球蚴病有一定的治療作用。人是多房棘球絳蟲非適宜的中間宿主，病灶內(nèi)原頭節(jié)幾乎沒有，這表明阿苯達(dá)唑代謝產(chǎn)物還可能通過影響包蟲-宿主界面微環(huán)境限制病灶的外生性生長(zhǎng)。因此，噻蟲啉也可能通過抑制包蟲-宿主界面微環(huán)境發(fā)揮抗包蟲病作用。組織病理學(xué)檢查顯示，噻蟲啉作用后生發(fā)層明顯破壞，僅表現(xiàn)為大量空泡狀結(jié)構(gòu)，表明噻蟲啉對(duì)包蟲病囊腫組織有直接的破壞作用，從而抑制囊泡生長(zhǎng)，發(fā)揮抗多房棘球蚴病的作用。

包蟲-宿主界面微環(huán)境類似于腫瘤微環(huán)境[20]，但表現(xiàn)為感染性肉芽腫反應(yīng)[21-23]，包蟲-宿主界面微環(huán)境是感染性肉芽腫中最關(guān)鍵部分。寄生蟲刺激下通過各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子募集成纖維細(xì)胞及多種免疫細(xì)胞，與寄生蟲相互作用，支持寄生蟲的生長(zhǎng)、存活和轉(zhuǎn)移。噻蟲啉作用后引起小鼠脾臟指數(shù)增加，表明噻蟲啉可能對(duì)包蟲感染后小鼠的免疫系統(tǒng)有刺激作用，但本研究未進(jìn)一步探討其對(duì)免疫細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的影響。但免疫應(yīng)答的激活被認(rèn)為參與抗多房棘球蚴感染[24]。

噻蟲啉與煙堿相比優(yōu)勢(shì)在于其較低的毒性[10]。事實(shí)上，噻蟲啉廣泛應(yīng)用于控制貓、狗的體表寄生蟲[11]。體外CCK-8試驗(yàn)結(jié)果表明80 μg/mL以下噻蟲啉沒有明顯的肝細(xì)胞毒性作用。此外，40 mg/kg以下噻蟲啉對(duì)肝、腎組織形態(tài)和血清肝腎功能指標(biāo)無影響，證實(shí)了噻蟲啉的低毒作用。雖說噻蟲啉毒性低，但高劑量的噻蟲啉對(duì)骨髓紅細(xì)胞和染色體仍存在一定的影響[25]。

本研究證實(shí)了噻蟲啉在體內(nèi)外均能發(fā)揮抗多房棘球蚴的作用，能提高包蟲感染小鼠的免疫能力，且沒有明顯的肝腎毒性。因此，噻蟲啉有成為開發(fā)抗包蟲病先導(dǎo)化合物的可能，但噻蟲啉是否作用于多房棘球絳蟲nAchRs以及對(duì)包蟲-宿主界面微環(huán)境調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：無