149株布魯氏菌病原快速診斷方法的評(píng)價(jià)

臺(tái)錦閣，汪定成，楊 銘，邵海連，蘇 博，郭鵬娟，陳靜文，董 軻

近年來，我國人獸共患病不斷增多，尤其以布魯氏菌病最為顯著。該病患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，無臨床特征性，容易造成漏診和誤診，給臨床診斷帶來棘手問題。目前，布魯氏菌病的診斷方法主要分為病原學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)診斷，前者其準(zhǔn)確率高，不易漏診，是布魯氏菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”；后者因?yàn)榇嬖诮徊婵乖安杉瘶?biāo)本不合格等原因會(huì)造成假陽性診斷結(jié)果[1]。此外，布魯氏菌對(duì)人體的致病力極強(qiáng)，易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室獲得性感染[2]。因此，確保實(shí)驗(yàn)室安全的情況下，快速準(zhǔn)確鑒定布魯氏菌顯得尤為重要。本文就布魯氏菌實(shí)驗(yàn)室快速鑒定的方法進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器 法國梅里埃BACT/ALERT3D240全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)及配套的培養(yǎng)瓶、荷蘭Mart Anoxomat Mark Ⅱ厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)、含溶血素厭氧培養(yǎng)瓶、美國Forma Class Ⅱ臺(tái)式生物安全柜、美國BD BECTEC FX全自動(dòng)血培養(yǎng)儀、泰斯特SPX-150B Ⅲ生化培養(yǎng)箱、奧林巴斯CX21顯微鏡。

1.2試劑 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基及巧克力培養(yǎng)基(購自鄭州安圖生物技術(shù)有限公司)、美國BD BECTEC FX全自動(dòng)血培養(yǎng)儀配套的樹脂需氧培養(yǎng)基。

1.3菌株采集 149株布魯氏菌(剔除同一病號(hào))分離自本院2014年1月至2019年9月臨床的血液、骨髓、關(guān)節(jié)腔液、引流液、腦脊液等標(biāo)本。經(jīng)無菌操作將3～10 mL標(biāo)本接種于血培養(yǎng)儀配套的培養(yǎng)瓶中，經(jīng)全自動(dòng)血培養(yǎng)儀掃描識(shí)別后直接放進(jìn)培養(yǎng)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4實(shí)驗(yàn)室快速鑒定方法 首先將所采集標(biāo)本進(jìn)行血培養(yǎng)，根據(jù)陽性瓶報(bào)警時(shí)間和觀察細(xì)菌生長曲線對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步判斷，如果陽性報(bào)警時(shí)間較長且生長曲線有明顯的“布魯氏菌”曲線特征，則高度懷疑為布魯氏菌；再用注射器抽取所懷疑血培養(yǎng)瓶中的樣本，一部分用于涂片并進(jìn)行革蘭染色，瑞氏染色和石碳酸復(fù)紅單染，然后觀察顯微鏡鏡下形態(tài)，與此同時(shí)，另一部分轉(zhuǎn)種血平板、巧克力平板及麥康凱平板，并于35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察細(xì)菌生長情況，并進(jìn)行觸酶，氧化酶，尿素水解試驗(yàn)，根據(jù)鏡檢的“布魯氏菌”特征形態(tài)及生化反應(yīng)結(jié)果為2 h內(nèi)尿素水解陽性，氧化酶、觸酶均為陽性則可確診為布魯氏菌。

2 結(jié) 果

2.1布魯氏菌病患者的統(tǒng)計(jì)情況 臨床分離的149株布魯氏菌，其中男性占110株，女性占39株，年齡分布在1～81歲，兒童占3株。該病患者最常見的臨床表現(xiàn)是發(fā)熱，典型病例表現(xiàn)為波狀熱，常伴有寒戰(zhàn)等癥狀；其次是多汗，布魯氏菌病急性患者出汗尤重，可濕透衣褲、被褥等；還有一些患者表現(xiàn)為全身肌肉和多發(fā)性、游走性大關(guān)節(jié)疼痛；少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)脊柱(腰椎為主)骨關(guān)節(jié)疼痛、畸形和功能障礙等。本文所涉及到的149例患者中，143株患者有明確的牛羊接觸史，4株有吃牛羊肉或者喝生牛羊奶的情況，2株有犬類接觸史。

2.2布魯氏菌陽性報(bào)警時(shí)間 布魯氏菌的陽性報(bào)警時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他細(xì)菌，因此可以通過陽性報(bào)警時(shí)間對(duì)細(xì)菌類型做出初步判斷[3]。本文中149株布魯氏菌在血培養(yǎng)儀上陽性報(bào)警時(shí)間為58.9～124.3 h，均值為73.8 h。具體分布時(shí)間見表1。

表1 來源于不同標(biāo)本的布魯氏菌在全自動(dòng)血培養(yǎng)儀中陽性報(bào)警時(shí)間(株)

2.3布魯氏菌生長曲線 細(xì)菌在血培養(yǎng)瓶中的生長繁殖過程可劃分為遲緩期、生長期和穩(wěn)定期3個(gè)過程，布魯氏菌是專性需氧菌，生長緩慢。布魯氏菌血培養(yǎng)生長曲線如圖1所示，其特征為遲緩期曲線較平坦，生長期曲線短且幅度小，穩(wěn)定期曲線平坦。圖2和圖3分別為大腸埃希菌生長曲線和金黃色葡萄球菌生長曲線，其與布魯氏菌血培養(yǎng)生長曲線有明顯的區(qū)別。

圖1 布魯氏菌生長曲線 圖2 大腸埃希菌生長曲線 圖3 金黃色葡萄球菌生長曲線

2.4細(xì)菌學(xué)和生化功能鑒定 鏡檢：革蘭染色鏡下發(fā)現(xiàn)呈片狀的革蘭陰性小球桿菌，染色很弱，不易觀察；瑞氏染色鏡下可見紫色的小球桿菌單個(gè)或成堆或像細(xì)沙樣；石碳酸復(fù)紅單染鏡下可見紅色的小球菌成泥沙樣，其鏡下染色圖片分別為圖4、圖5、圖6(放大倍數(shù)均為10×100)，不同染色方法所觀察到的布魯氏菌分別如圖中箭頭所示。接種的平板在35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，血平板及巧克力培養(yǎng)平板上生長出針尖大小的菌落類似一層血膜，延長培養(yǎng)到72 h，生長出較小、灰色、圓形、突起、邊緣整齊且不溶血的大小相同的菌落，麥康凱平板上無菌落生長，其生化反應(yīng)結(jié)果為2 h內(nèi)尿素水解陽性，氧化酶、觸酶均為陽性。

圖4 布魯氏菌革蘭染色 圖5 布魯氏菌瑞氏染色 圖6 布魯氏菌石碳酸復(fù)紅單染

3 討 論

布魯氏菌病，是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的人獸共患病，是全世界范圍的動(dòng)物源性傳染病[4]。布魯氏菌病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸比較復(fù)雜，其臨床表現(xiàn)多種多樣，很難以某一種癥狀來確診，臨床醫(yī)生多因發(fā)熱考慮菌血癥，送檢血液培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)，部分實(shí)驗(yàn)室因經(jīng)驗(yàn)不足，未能培養(yǎng)鑒定出細(xì)菌，造成漏診。目前，布魯氏菌病確診實(shí)驗(yàn)方法主要有布魯氏菌培養(yǎng)鑒定、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、抗人免疫球蛋白試驗(yàn)(Coomb′s)和聚合酶聯(lián)反應(yīng)等[5]，但是布魯氏菌培養(yǎng)鑒定和試管凝集試驗(yàn)(SAT)是最常見的診斷方法。其中，試管凝集試驗(yàn)(SAT)不屬于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展的方法，而是由疾病控制中心開展的項(xiàng)目，常用于流行病調(diào)查研究。臨床科室一般通過細(xì)菌培養(yǎng)鑒定為布魯氏菌后，運(yùn)送標(biāo)本至疾病控制中心進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)(SAT)復(fù)檢。

因此，實(shí)驗(yàn)室目前診斷布魯氏菌最可靠的方法還是以細(xì)菌培養(yǎng)為主，該法通常在血培養(yǎng)瓶報(bào)陽后進(jìn)行接種，常規(guī)培養(yǎng)72 h左右，待有灰白色菌落生成后進(jìn)行生化鑒定[6]。而本文所采用的是對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化后的方法，其主要特點(diǎn)在于血培養(yǎng)瓶報(bào)陽后，直接取一部分樣品進(jìn)行革蘭染色和石碳酸復(fù)紅單染，由于布魯氏菌屬于革蘭陰性小型球桿菌，經(jīng)革蘭染色該菌呈細(xì)沙樣且細(xì)胞壁不易被堿性復(fù)紅復(fù)染，著色較淡不易被發(fā)現(xiàn)，分離的149例布魯氏菌中85例鏡下革蘭染色陰性，未能明顯看見細(xì)菌，經(jīng)驗(yàn)不足的人員不易分辨。但經(jīng)石碳酸復(fù)紅單染，鏡下明顯可見櫻紅色的小球菌成泥沙樣排列，提示有細(xì)菌存在，結(jié)合革蘭染色和石碳酸復(fù)紅單染的染色結(jié)果，高度懷疑為布魯氏菌；與此同時(shí)，取另一部分樣品接種培養(yǎng)18～24 h，隨后通過生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定，縮短了報(bào)告時(shí)間。因而本文所述方法較常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法相比更加快速。值得注意的是，本文無法參考標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行鑒定，因?yàn)楦鶕?jù)《中華人民共和國動(dòng)物防疫法》規(guī)定，布魯氏菌病為乙類傳染病，其標(biāo)準(zhǔn)菌株在國內(nèi)沒有購買途徑。本文所涉及到的布魯氏菌都是通過凝集實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜來進(jìn)行驗(yàn)證的。

本文中的149株布魯氏菌以血液和骨髓標(biāo)本來源為主，分別為89株和46株，有少量標(biāo)本來源于關(guān)節(jié)腔液，極少量存在于膿液和腦脊液中。在149株布魯氏菌中，有兩株臨床反饋的結(jié)果為陰性，該兩名患者否認(rèn)牛羊接觸史和食用未熟的肉制品、奶制品，但有飼養(yǎng)犬類，臨床科室按照布魯氏菌病治療方案對(duì)患者進(jìn)行治療，病情明顯好轉(zhuǎn)，則可判斷為犬布魯氏菌感染。造成SAT凝集結(jié)果為陰性的最主要原因可能是由于犬布魯氏菌屬于粗糙型菌，不適合用光滑型菌SAT抗原檢測(cè)，即由于抗原表位的不同，布魯氏桿菌可以表現(xiàn)為SAT陰性[7-9]。此外，也不排除可能受采樣及血清中抗體濃度的影響等[6]。SAT凝集方法對(duì)產(chǎn)生癥狀的急性感染患者更加敏感，但對(duì)于慢性患者很容易造成漏診，比如Sanodze等人研究發(fā)現(xiàn)該方法在布魯氏菌病的早期診斷中其靈敏度很低[10-11]。同時(shí)，對(duì)于流行區(qū)患者，由于高背景抗體效價(jià)等原因，會(huì)出現(xiàn)假陰性，因此，可能存在多種因素導(dǎo)致該方法對(duì)布魯氏菌病診斷的準(zhǔn)確率并沒有本文所述的方法高。

綜上所述，本文所采用的實(shí)驗(yàn)室布魯氏菌診斷方法的準(zhǔn)確率高，快速且具有較高的生物安全性，說明了病原學(xué)診斷在一定程度上優(yōu)于血清學(xué)診斷。

利益沖突：無