2014-2019年阜陽(yáng)市食品和病人分離單增李斯特菌的分子特征分析

孟昭倩，段 然，呂東月，郭國(guó)俠，郭靚子，卜 戈

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，屬于李斯特菌屬，為革蘭陽(yáng)性短小桿菌，廣泛分布于自然界，是重要的食源性人獸共患病原菌之一[1]。可引起人和多種動(dòng)物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等[2]。該菌環(huán)境耐受性較強(qiáng)，溫度要求不高，0 ℃～45 ℃均能生存和繁殖。研究表明，李斯特菌病散發(fā)和暴發(fā)的重要原因是食入被Lm污染的食品[3]，主要感染者為免疫力低下的人群、孕婦和新生兒[4-5]，據(jù)報(bào)道新生兒感染該菌死亡率最高達(dá)56%[6]。為了解Lm的流行病學(xué)特性，本研究對(duì)阜陽(yáng)市2014-2019年從食品和病人樣本中分離的55株Lm進(jìn)行毒力基因、MLST和PFGE分型分析，以建立Lm分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)，為本地單增李斯特菌病的預(yù)防控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來(lái)源 共55株Lm納入本研究，其中3株病人菌株分別分離自早產(chǎn)孕婦的胎膜(胎死宮內(nèi))、早產(chǎn)嬰兒的腦脊液、肝硬化敗血癥病人的血液；52株食品株分離于2014-2019年阜陽(yáng)市食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)樣品，樣品采集按照安徽省食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作方案要求，采集于本市幾個(gè)綜合性超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、餐飲店的生畜肉、熟肉、沙拉和豆制品等。

1.1.2主要試劑和儀器 培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)、DNA提取試劑(江蘇百世諾醫(yī)療科技有限公司)、限制性內(nèi)切酶AscI(New England Biolabs)、毒力基因和管家基因引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。全自動(dòng)微生物鑒定儀VITEK2(法國(guó)梅里埃公司)、全自動(dòng)核酸提取儀(臺(tái)灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)開發(fā)有限公司)、凝膠成像及脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)擴(kuò)增儀、電泳儀(DYY-C6北京市六一儀器廠)。所用培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2 方 法

1.2.1菌株復(fù)蘇和培養(yǎng) 取-80 ℃磁珠凍存管保存的55株Lm，用Lm顯色培養(yǎng)基復(fù)蘇培養(yǎng)。36 ℃培養(yǎng)24 h，菌落為藍(lán)色，周圍有白色暈環(huán)，鏡檢為革蘭陽(yáng)性小桿菌，在動(dòng)力培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)48 h呈倒傘型，所有菌株均經(jīng)生化鑒定或全自動(dòng)微生物鑒定儀VITEK2鑒定確認(rèn)為L(zhǎng)m。

1.2.2模板制備 將鑒定后的55株Lm接種于腦心浸瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，取2～3個(gè)菌落接種于5 mL LB增菌肉湯，36 ℃ 260 r/min過夜震蕩培養(yǎng)，按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA，即為擴(kuò)增模板。

1.2.3毒力基因檢測(cè) 采用PCR方法檢測(cè)Lm的6個(gè)毒力基因prfA、plcB、hly、actA、iap、inlA。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，220 V 20 min。Lm的6個(gè)毒力基因的檢測(cè)引物[7-9]及產(chǎn)物大小見表1。

表1 單增李斯特菌毒力基因檢測(cè)引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.4分子分型

1.2.4.1PFGE分型 根據(jù)國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)技術(shù)規(guī)范單增李斯特菌PFGE操作程序，制備55株Lm和沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株(H9812)DNA膠塊，用限制性內(nèi)切酶AscI和XbaⅠ分別對(duì)Lm和沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株(H9812)DNA膠塊進(jìn)行酶切37 ℃ 3 h，電泳19 h，初始轉(zhuǎn)換時(shí)間4.0 s，終末轉(zhuǎn)換時(shí)間40.0 s，電泳染色后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照，轉(zhuǎn)化為tif格式，再用BioNumerics7.6軟件對(duì)獲得的PFGE電泳圖譜進(jìn)行聚類分析。

1.2.4.2MLST分型 采用abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh、lhkA共7對(duì)管家基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s(blgA基因退火溫度為45 ℃)，72 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。單增李斯特菌7個(gè)管家基因引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度見參考文獻(xiàn)[10]、經(jīng)電泳結(jié)果確認(rèn)后將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Seqman軟件檢驗(yàn)與拼接，以Mega軟件截取比對(duì)序列，結(jié)果與Lm的 MLST 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.mlst.net)進(jìn)行比對(duì)獲得管家基因編號(hào)及ST型別的唯一序列號(hào)。運(yùn)用 BioNumerics 7.6軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1毒力基因分布 3株病人分離菌株和52株食品分離菌株的6種毒力基因prfA、plcB、hly、actA、iap、inlA全部為陽(yáng)性。

2.2MLST分型結(jié)果 55株Lm共分為14個(gè)ST型，其中52株食品株Lm分為13個(gè)ST型，包括ST9型(24株)、ST5型(6株)、ST121型(4株)、ST8型(4株)、ST297型(3株)、ST11型(2株)、ST155型(2株)、ST224型(2株)、ST3型(1株)、ST87型(1株)、ST321型(1株)、ST378型(1株)、ST575型(1株)。病人分離的3株Lm分別為ST87型、ST91型和ST224型。ST87型、ST224型為食品和病人菌株共有型別。所有菌株以ST9為優(yōu)勢(shì)型別(24/55，43.64%)，其次為ST5型(6/55，10.91%)、ST121/ST8(4/55，7.27%)，ST224/ST297(3/55，5.45%)(圖1)。優(yōu)勢(shì)的ST9型菌株在2014-2018年均有出現(xiàn)。

Note: Each circle represents a single ST.The diameter of the circle was proportional to the number of strains.The number of different alleles between STs was on the lines between ST.

2.3PFGE分型結(jié)果 55株Lm菌經(jīng)AscI酶切電泳后共分為21個(gè)帶型(PT型)，相似度60.3%～100%。其中GX6A16.AH0007(19/55)為優(yōu)勢(shì)PT型，且均為ST9型菌株。圖2的聚類分析顯示，52株食品菌株中存在同一年份分離菌株分屬于不同分支，而不同年份分離菌株有相同型別的現(xiàn)象。2016和2018年食品分離的3株菌均為GX6A16.AH0006型，其中2株為ST9型，1株為ST575型；2017年在同一超市熟食柜、同時(shí)采樣的兩種涼拌菜分離的菌株其PT型和ST型均不相同，千張豆腐分離菌株FY2017050為GX6A16.AH0007和ST9型，而涼拌豆餅分離菌株FY2017052為GX6A16.AH0001和ST155型別。3株病人分離菌株的PT型和ST型互不相同；2018年病人腦脊液分離菌株FY2018071和2014年食品分離菌株2014151、2014152的PT型和ST型完全一致，分別為GX6A16.AH0014和ST224型；2019年病人胎膜分離的菌株FY2019026和2014年食品分離菌株2014012的PT型和ST型完全一致，分別為GX6A16.AH0015和ST87型；2019年病人血液分離菌株FY2019039為GX6A16.AH0004和ST91型。

圖2 55株單增李斯特菌PFGE聚類圖、序列型別

3 討 論

Lm是一種重要的食源性致病菌，在生畜肉、熟肉、沙拉等食品中均可檢出。誤食了被該菌污染的食物可引起李斯特菌病，尤其對(duì)免疫力低下的患者和圍產(chǎn)期婦女造成的危害更為嚴(yán)重。近年來(lái)報(bào)告的李斯特菌病病例逐漸增多[11-15]。

Lm的致病性與其所攜帶的毒力基因密切相關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)的毒力基因較多，這6個(gè)毒力基因prfA、plcB、hly、actA、iap、inlA功能較為清楚。hly基因編碼的溶血素是 Lm 的重要毒力因子，溶血素與Lm的致病性密切相關(guān)；iap基因編碼的 P60蛋白是Lm的重要抗原，與侵襲性有關(guān)；prfA是毒力調(diào)控基因，可轉(zhuǎn)錄和調(diào)控Lm的多種毒力基因；inlA基因編碼內(nèi)化素，介導(dǎo)細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞；actA基因編碼肌動(dòng)蛋白，為細(xì)菌運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力；plcB編碼磷脂酰膽堿磷脂酶, 與細(xì)菌的擴(kuò)散能力有關(guān)[16-18]。本研究從多類食品特別是熟肉、沙拉、涼拌菜等直接食用的食品中分離到的Lm均具有這6種毒力基因，提示這些食源性Lm對(duì)人們健康存在潛在威脅，有出現(xiàn)食源性感染性暴發(fā)疫情的可能性，應(yīng)引起衛(wèi)生監(jiān)督部門的高度重視。

PFGE技術(shù)因分辨率高、分型能力強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)被譽(yù)為細(xì)菌性傳染病病原分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[9]。通過對(duì)電泳條帶的比較分析可以反映出不同菌株的相關(guān)性。本次聚類分析結(jié)果表現(xiàn)為多樣性，55株Lm分為21個(gè)PT型。3株病人分離株為不同的PT型，存在病人菌株和食品菌株型別完全一致情況；52株食品株中相同年份有多種帶型共存，不同年份菌株存在相同的帶型。說(shuō)明食品銷售環(huán)境中具有多種型別的Lm持續(xù)存在，有可能隨著地區(qū)間食品運(yùn)輸和銷售鏈進(jìn)行擴(kuò)散傳播，因此食品安全需要加強(qiáng)對(duì)污染食品的監(jiān)管。

MLST通過比對(duì)Lm 7個(gè)管家基因的核苷酸序列多樣性，進(jìn)而研究菌株間的遺傳相關(guān)性和種群結(jié)構(gòu)的一種基因分型方法。本研究中使用MLST將55株Lm分為14個(gè)ST型，其中52株食品分離株中優(yōu)勢(shì)菌株為ST9型，其次為ST5、ST121、ST8、ST297、ST224，與馬愛靜，霍哲等的研究結(jié)果相似[3,19]。3株病人分離菌株型別各不相同，而有2株病人和食品分離菌株型別相同。2019年分離于早產(chǎn)孕婦胎膜(胎死宮內(nèi))的菌株FY2019026和2014年食品分離株2014012的PFGE帶型和MLST型別完全相同，為GX6A16.AH0015和ST87型，ST87型菌株為單增李斯特菌病病例樣本中多見型別[20]；菌株FY2019039分離于肝硬化敗血癥病人的血液，其PFGE帶型和MLST型為GX6A16.AH0004和ST91，暫未發(fā)現(xiàn)與其型別相同菌株；菌株FY2018071分離于早產(chǎn)嬰兒的腦脊液，和2014年食品分離菌株FY2014151、FY2014152 的PFGE帶型和MLST型別完全相同，均為GX6A16.AH0014和ST224型，說(shuō)明Lm的一些型別菌株可持續(xù)多年污染本地的食品并具有致病性，對(duì)人群具有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)。這種食品株和病人株型別相同的現(xiàn)象在國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的研究中也有報(bào)道[20-21]。

由圖2可以看出多數(shù)菌株P(guān)T型相同ST型相同；有些菌株ST型相同PT型不同，有些菌株P(guān)T型相同ST型不同，如FY2016038、FY2018004、FY2018021的PT型相同均為GX6A16.AH0006，而MLST型菌株FY2016038為ST575型、菌株FY2018004和FY2018021為ST9型。PFGE可分析細(xì)菌之間的相關(guān)性，追溯感染來(lái)源，MLST通過分析每個(gè)管家基因的核苷酸序列特征，反映菌株間的遺傳相關(guān)性、克隆性。對(duì)ST型、PT型均一致的食品和病人菌株進(jìn)行基因組測(cè)序分析，可進(jìn)一步確定是否為相同或相近克隆來(lái)源菌株等。同一超市熟食柜、同時(shí)采樣的兩種涼拌菜，PT型和ST型均不相同，PT型為GX6A16.AH0007和GX6A16.AH0001，ST型為ST9和ST155。說(shuō)明該熟食柜同時(shí)存在多種型別的Lm污染，并且攜帶毒力基因，說(shuō)明我市具有食源性李斯特菌病散發(fā)和暴發(fā)的潛在危險(xiǎn)。應(yīng)加強(qiáng)食源性Lm的病原監(jiān)測(cè)、感染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、食品衛(wèi)生監(jiān)管措施等。

本研究采用分子分型技術(shù)對(duì)阜陽(yáng)市2014-2019年病人和食品樣本中分離的55株Lm進(jìn)行分子分型分析，同時(shí)檢測(cè)其毒力基因，建立了Lm分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)，為本市李斯特菌病的預(yù)防控制提供了參考依據(jù)。

利益沖突：無(wú)